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《东北农业大学》 2013年
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桃红色果肉性状的分子标记及序列分析

韩继成  
【摘要】:由于桃世代周期长,利用传统的育种方法培育一个新品种需要10多年的时间,并且树体高大,进行杂交选种时需要占用大量的土地。近年来兴起的分子标记辅助育种技术可以有效缩短育种周期。在桃性状的分子标记方面前人已经做了大量的工作。在桃果实性状分子标记方面,已研究了果实果肉黄色和白色、有毛/无毛、果实非酸/酸性状、和果实成熟期等,对果实中不同部位花青素分布的分子标记还未见报道。SRAP标记技术是一种多态性和信息量丰富的新型分子标记技术,近年来在植物遗传多样性分析、种质鉴定、遗传连锁图的构建以及比较基因组学研究等方面得到广泛应用。我们利用梯度PCR技术,对SRAP-PCR过程中的两步退火温度进行了研究,以期获得较好的退火温度组合。我们利用桃品种的两个杂交群体重阳红×燕红和重阳红×大久保的后代,应用优化后的SRAP反应条件以及利用SSR标记等两种标记方法结合BSA方法对桃果肉不同部分的红色素进行了标记研究,并对获得的与桃果实近核色素紧密连锁的SRAP标记Me07Em02扩增得到的片段进行了回收、测序和分析,并登录桃基因组Peach v1.0进行了比对。研究结果如下: 1.SRAP-PCR退火温度的优化:根据已有文献设计了8条正向引物和11条反向引物,组合成88对引物,利用梯度PCR仪(型号:MJ200PCR),对SRAP-PCR过程中的两步退火温度进行了研究。通过对第一步前5轮循环的退火温度梯度(37.0℃,37.3℃,38.1℃,39.1℃、40.6℃,42.5℃,44.7℃,46.5℃,48.0℃,49.0℃,49.7℃,50.0℃)的实验,其退火温度可提高到41℃;对第二步后30轮循环的退火温度梯度(50.0℃,50.3℃,50.9℃,51.7℃,52.8℃,54.3℃,56.0℃,57.4℃,58.5℃,59.3℃,60.0℃)的实验,其退火温度可提高到52℃,同时发现不同的退火温度可扩增出不同的条带,并非随着退火温度的提高,可扩增条带减少,有些条带较高退火温度下出现。应用该程序,使用多个SRAP引物组合在桃品种进行扩增验证,均获得了良好的重复性结果。 2.以“重阳红”与“燕红”两个桃(Prunus persica(L.) Batsch)品种为亲本构建群体,通过对正交F1代果实果肉红色素多年的调查,分别对红色素在皮下、果肉和近核果肉的分布进行统计,在此基础上采用分离群体分组分析(bulked segregate analysis, BSA)法,将果肉红色素在果肉三个部位的分布分别记为“有”和“无”两个基因池,共3对6个基因池。应用优化后的相关序列扩增多态性(SRAP)和简单序列重复(SSR)分子标记技术法筛选与桃果肉红色素不同部位分布性状基因连锁的分子标记。通过对88对SRAP引物组合和分别来自桃属(Prunus persica)和苹果(Malus×domestica)的481对SSR引物组合同时在6个基因池间进行筛选,在各基因池间共筛选出4对SRAP引物组合(Me01Em08、Me05Em03、Me07Em04和Me07Em02)和5对SSR引物(UDP97-402、BPPCT023、UDP96-003、CH04g09、CPPCT028)。经138个单株的验证,该标记稳定出现。采用作图软件Mapmaker和回交群体模型进行标记分群和连锁分析,设定LOD值为3和最大重组值θ为0.50作为可信统计度与最大连锁标记数量之间的最佳组合,通过计算这些标记与桃果肉红色素性状基因的遗传距离。结果表明这些标记分别位于桃参考遗传连锁图谱的G2和G4两个连锁组,并分别与红色素在皮下和果肉的分布以及红色素在近核处果肉的分布相连锁。其中与红色素在近核处果肉的分布的标记为6个(UDP96-003、UDP97-402、Me01Em08、Me07Em02、CH04g09和Me07Em04),与红色素在皮下和果肉的分布的标记3个(BPPCT023、CPPCT028和Me05Em03),其中,SRAP标记Me07Em02与桃果实近核色素的遗传距离为0.0cM。 3.通过将SRAP引物组合在重阳红×大久保杂交群体中的扩增结果结合调查所得的近核色素数据,利用作图软件Mapmaker和回交群体模型进行计算该标记与桃果肉近核色素性状基因的遗传距离为2.1cM。 通过对与桃果实近核色素的紧密连锁的SRAP标记Me07Em02扩增片段的5个克隆的回收、T7/SP6双向测序,所测序的5个克隆序列完全一致,其全长110bp,其序列为:TGAGTCCAAACCGGTCCTGCTCAAGTGGAACCACATTGAGAACATGGCGCTCTAGCAGAGTGCAAAATAAGCAACTCTTTCAGTCTGCCATTGCAAATTCGTACGCAGTC(下划线部分序列为引物序列)。通过提交到桃基因组序列网站进行BLASTn比对,该序列在桃基因组序列上是单一拷贝,位于桃基因组序列Peach v1.0的scaffold_4上,应用DNAMAN序列分析软件分析该序列,表明该序列最大ORF框为108个bp,编码36个氨基酸,其氨基酸序列为:SPNRSCSSGTTLRTWRSSRQNKQLFQSAIANSYAV,该蛋白质序列在GenBank蛋白质序列库中没有比对出相似序列。 克隆了与桃果实果肉连锁的其它SRAP标记序列,其中一个是是桃反转录转座子的部分序列,另一个可能是putative calcium-transportingATPase13的部分序列。 4.根据获得的桃反转录转座子的部分序列,应用DANMAN和DNASTAR序列分析软件辅助,在桃基因组数据库和GenBank中进行BLASTn比对获得了桃反转录转座子的全基因组序列,位于Peach v1.0基因组的Scaffold-1的9939764bp-9944771bp位置,全长5008bp,其左右两边的LTR完全一致,长度为444bp,其最大ORF框位于该序列的487bp-4545bp,编码1535个氨基酸,将该氨基酸序列提交到GenBank中进行Protein BLAST比对,结果显示该序列也具有典型的copia-like反转录转座子的氨基酸序列特征。同时初步建立了桃反转录转座子标记方法,并对桃的遗传多样性进行了分析。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:S662.1

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【参考文献】
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