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《东北农业大学》 2016年
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番茄抗叶霉病基因Cf-19的精细定位及抗病应答基因筛选

赵婷婷  
【摘要】:番茄叶霉病由病原菌Cladosporium fulvum(C.fulvum)引起,是栽培番茄中的一种较为严重的病害。通过育种获得含有抗病基因的抗性品种可以在番茄生产中有效地控制叶霉病的发生,但是新的抗病基因的使用同时也加速了叶霉菌生理小种的分化。目前包括Cf-2、Cf-4和Cf-6等很多基因已经对某些生理小种失去了抗性,所以急需发掘新的抗病基因来满足育种的需要;番茄与病原菌C.fulvum的非亲和互作遵守基因对基因假说(gene-for-gene)。目前为止关于Cf与Avr基因产物相互作用的研究主要集中在Cf-4/Avr4和Cf-9/Avr9上。Cf-9与Cf-4蛋白的氨基酸序列的一致性达到91%以上,Avr9与Avr4之间却没有明显的同源性,并且它们之间引发的超敏反应也有很大不同,造成这种差异的具体机制尚不明确,对未知的Cf基因引发的超敏反应进行研究将有助于拓宽研究思路并加深我们对Cf/Avr互作机理的认识,甚至为抗病育种开辟新的道路。含有Cf-19基因的番茄材料在多年的栽培实践中表现出了有效的抗病性,可以作为抗性育种的新型候选材料。Cf-19基因在1980年被定位在2号染色体的长臂上,之后对于该基因的研究一直处于停滞状态,严重影响了Cf-19基因在育种中的应用。我们通过对Cf19基因的抗性范围、抗性特点、遗传规律以及基因定位进行系统的研究,并对该基因介导的抗性应答过程中相关的差异表达基因进行筛选和表达模式分析,从而对Cf-19基因从表型抗病特点到基因遗传特征乃至抗病应答机制有了较为全面的认识,这将为今后Cf-19基因在育种中的应用提供理论依据,同时为Cf19基因的克隆以及进一步研究Cf/Avr互作机理奠定基础。本研究采用台盼蓝染色、高通量测序技术、荧光定量PCR技术以及cDNA-AFLP等多种方法进行不同方向的研究,主要获得了以下成果:(1)通过人工接种鉴定确定了Cf-19基因的抗性范围,该基因对叶霉病菌生理小种1.2.3和1.2.3.4表现免疫,对生理小种1.2.3.4.5和1.2.3.4.9表现高抗,抗性范围基本涵盖了我国叶霉病菌生理小种范围。(2)通过对充分发生抗病反应的叶片进行染色观察,对比Cf-4和Cf-9叶片超敏反应坏死斑的分布情况,发现Cf-19基因介导的超敏反应强度介于Cf-4和Cf-9之间,坏死斑面积较大,整体上大致沿着叶脉附近分布。(3)通过对两个F2代群体进行人工接种鉴定,统计结果显示所有母本及F1均表现抗病,所有父本均表现感病,根据适合性测验结果,F2群体的抗感比均符合3:1分离规律,BC1群体抗感比均符合1:1分离规律,Cf-19的遗传模式符合孟德尔遗传定律中的显性单基因遗传规律。(4)通过对CGN18423和Moneymaker与病原菌C.fulvum之间的互作过程进行观察,发现病原菌对叶表皮细胞的侵染发生在接种后第4天,第5天开始出现细胞死亡,第5天到第7天之间,形成典型的过敏性坏死斑,第7天至第10天,过敏性坏死斑内部的菌丝逐渐消失,第10天到第21天之间,过敏性坏死斑增多并在有限范围内扩展。共发现并总结出7个关键时间点:接种后第0、4、5、7、10、15和21天。(5)通过父、母本重测序,SLAF-seq分析,基因功能注释以及标记开发和表达模式验证等多种手段结合,将Cf-19基因定位在1号染色体短臂的2.14Mb区间内,经筛选获得2个候选基因位点Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1,其中Solyc01g006550.2.1与Cf-0为等位基因,位于Cf-4/9基因位点。(6)候选基因及氨基酸序列结构分析显示,在抗感材料中Solyc01g005870.1.1保守结构域无明显差别。而本研究中发现的抗病材料Solyc01g006550.2.1位点基因(KT845954)则为Cf-4/9基因位点上又一新成员,该基因中的60bp碱基片段插入为原Cf-0氨基酸序列提供了N端信号肽结构域,并且由于开放阅读框的改变而增加了LRR结构的数目。基因进化关系分析显示,抗病材料中的Solyc01g006550.2.1基因序列与Cf-4和Cf-9两个功能基因处于同一较高分化水平,且同源关系较近,与其它非功能型Cf-4/9位点基因同源关系较远。而Solyc01g005870.1.1基因序列则与Cf-0基因处于同一较低分化水平,与其它Cf-4/9位点基因同源关系较远。(7)开发了一个与抗病性状共分离的共显性SCAR标记P7。该标记在CGN18423中可以扩增出大小为300bp的条带,在Moneymaker中可以扩增出大小为240bp的条带,在F1中可以扩增出上述两条条带,该标记经过345株F2代植株连锁分析,以及3个不同基因型F3群体植株的验证,表现出稳定的共分离特性以及灵敏的基因分型功能,可以用于分子标记辅助育种。(8)采用cDNA-AFLP技术对Cf-19基因介导的抗性应答差异表达基因进行筛选,最终获得成功测序的TDFs共26个,登录号为JZ717721~JZ717746。其中大部分基因的种类和表达模式与Cf-4和Cf-9介导的抗性应答差异表达基因相同。(9)首次在Cf/Avr互作过程中发现TDF35(S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶1(SAMDC)基因)和TDF49(Eli3蛋白基因)。诱导模式表明SAMDC在Cf-19-C.fulvum互作体系中的一个或多个通路中发挥关键作用,而Eli3基因的表达可能依赖于R/Avr基因间互作的发生。TDF1与S.lycopersicum非特异性脂质转移蛋白(ns LTP)2-like基因有91%的同源性,并且在抗、感病材料中均表现为接种后上调表达。TDF14对应S.lycopersicum Bax抑制剂基因(BI-1;80%),在CGN18423和Moneymaker中均上调表达;TDF47是钙依赖性蛋白激酶的同源基因(CDPK),在Cf-19基因介导的防御应答反应中显著上调表达。(10)建立了有效的病毒诱导的基因沉默侵染技术体系,并成功构建了Cf-19候选基因(Solyc01g005870.1.1和Solyc01g006550.2.1),以及部分抗病应答相关基因的基因沉默载体(VIGS-TRV2)。
【关键词】:番茄 叶霉病 Cf-19基因 精细定位 高通量测序 抗性应答 表达模式
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S436.412.1
【目录】:
  • 摘要10-12
  • 英文摘要12-15
  • 1 前言15-28
  • 1.1 番茄叶霉病及抗病基因研究进展15-20
  • 1.1.1 番茄叶霉病发病特点15-16
  • 1.1.2 番茄叶霉病病原菌16-17
  • 1.1.3 番茄叶霉病抗病基因研究进展17-19
  • 1.1.4 番茄与病原菌互作研究进展19-20
  • 1.2 基因组重测序技术及其应用20-21
  • 1.2.1 高通量测序技术20-21
  • 1.2.2 高通量测序技术的应用现状21
  • 1.3 简化基因组测序技术及其应用21-23
  • 1.4 c DNA-AFLP技术及其应用23-24
  • 1.4.1 c DNA-AFLP技术23-24
  • 1.4.2 c DNA-AFLP技术的应用现状24
  • 1.5 病毒诱导基因沉默技术及其应用24-26
  • 1.5.1 病毒诱导基因沉默VIGS技术24-25
  • 1.5.2 VIGS技术的应用现状25-26
  • 1.6 研究的目的与意义26-27
  • 1.7 研究的内容与技术路线27-28
  • 1.7.1 研究内容27
  • 1.7.2 技术路线27-28
  • 2 材料和方法28-49
  • 2.1 Cf-19基因的抗性范围鉴定28-29
  • 2.1.1 实验材料28
  • 2.1.2 实验方法28-29
  • 2.2 Cf-19基因的抗病性特点研究29-30
  • 2.2.1 实验材料29
  • 2.2.2 实验方法29-30
  • 2.3 Cf-19基因的遗传规律分析30
  • 2.3.1 实验材料30
  • 2.3.2 实验方法30
  • 2.4 SLAF-seq分析30-34
  • 2.4.1 实验材料30
  • 2.4.2 实验方法30-34
  • 2.5 父、母本重测序分析34-35
  • 2.5.1 实验材料34
  • 2.5.2 实验方法34-35
  • 2.5.3 重测序数据与SLAF-Seq结果联合分析35
  • 2.6 候选基因筛选35-37
  • 2.6.1 关联区间内基因功能注释35
  • 2.6.2 Cf类型基因表达模式分析35-37
  • 2.7 候选基因位点精确测序及序列分析37-39
  • 2.7.1 候选基因位点精确测序37-39
  • 2.7.2 候选基因位点序列分析39
  • 2.8 标记开发及连锁关系分析39
  • 2.9 c DNA-AFLP分析39-45
  • 2.9.1 实验材料39-40
  • 2.9.2 实验方法40-45
  • 2.10 TDFs表达模式分析45-46
  • 2.10.1 实验材料45
  • 2.10.2 实验方法45-46
  • 2.11 候选基因及抗病相关基因功能沉默VIGS载体构建46-48
  • 2.11.1 基因片段扩增及纯化46-47
  • 2.11.2 TRV2载体制备47-48
  • 2.11.3 含有目的基因片段的TRV2载体构建48
  • 2.12 VIGS农杆菌侵染技术体系的建立48-49
  • 3 结果与分析49-73
  • 3.1 Cf-19基因的抗性范围鉴定49-50
  • 3.2 Cf-19基因的抗性特点研究50-52
  • 3.2.1 Cf-19基因与Cf-4、Cf-9 基因介导的过敏性坏死观察50-51
  • 3.2.2 Cf-19基因介导的非亲和互作与亲和互作过程观察51-52
  • 3.3 Cf-19基因的遗传规律研究52
  • 3.4 Cf-19基因的精细定位52-66
  • 3.4.1 SLAF-seq分析与父、母本材料的基因组重测序52-61
  • 3.4.2 候选基因表达模式分析61-63
  • 3.4.3 候选基因位点测序及序列分析63-64
  • 3.4.4 标记开发及连锁分析64-66
  • 3.5 抗病应答过程中差异表达基因的筛选66-72
  • 3.5.1 c DNA-AFLP分析66-70
  • 3.5.2 部分转录衍生片段表达模式验证与深入分析70-72
  • 3.6 基因沉默载体构建及侵染体系的建立72-73
  • 3.6.1 目的基因沉默载体构建72
  • 3.6.2 农杆菌侵染体系的建立72-73
  • 4 讨论73-78
  • 4.1 Cf-19基因的遗传规律73-74
  • 4.2 Cf-19基因介导的过敏性坏死特点74-75
  • 4.2.1 Cf-4、Cf-9 和Cf-19基因介导的过敏性坏死特征对比分析74
  • 4.2.2 Cf-19基因介导的抗病应答过程中关键时间点的确定74-75
  • 4.3 Cf-19基因的候选基因特征分析75-76
  • 4.3.1 候选基因Solyc01g006550.2.1 为Cf-4/9 基因位点的Hcr9s新成员75-76
  • 4.3.2 候选基因与其它Cf基因的进化关系分析76
  • 4.4 分子标记P7可应用于分子标记辅助选择育种76
  • 4.5 父、母本重测序与SLAF-seq结合使用可以提高定位效率76-77
  • 4.6 Cf-19基因介导的抗性应答反应中的重要差异表达基因77-78
  • 4.7 VIGS侵染体系78
  • 5 结论78-79
  • 6 创新点79-80
  • 致谢80-81
  • 参考文献81-89
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文89

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