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《东北农业大学》 2016年
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三氯化铝诱导大鼠骨质疏松的TGF-β_1/Smad信号转导机制

刘剑郁  
【摘要】:为揭示三氯化铝(AlCl_3)诱导大鼠骨质疏松的TGF-β_1/Smad信号转导机制,本研究进行了AlCl_3诱导骨质疏松大鼠的体内实验和体外成骨细胞(OB)染铝实验的相关研究。体内实验以SD大鼠为受试对象,将100只4周龄SD大鼠随机均分成染铝组和对照组,染铝组大鼠按64 mg/kg·B.W.饮用Al Cl_3·6H2O水溶液,对照组饮用蒸馏水,每隔30d采用双能X线骨密度仪检测大鼠骨密度(BMD)和记录大鼠体重。染铝120d时大鼠脱颈致死,分别测定血清和骨中铝、钙、磷含量,骨组织氧化与抗氧化状态,血清B-ALP、TRACP-5b活性和PINP、NTX-I含量,骨组织B-ALP、TRACP-5b、TGF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4和Smad7mRNA表达,骨组织T GF-β_1、p-Smad2/3蛋白表达和p-Smad2/3/4复合物形成及其入核情况,并对染铝大鼠骨组织的骨细胞超微结构进行观察。体外实验以新生SD大鼠颅骨成骨细胞(OB)为受试对象,向OB中分别添加终浓度为0.12mg/m L Al Cl_3·6H2O(Al Cl_3处理组,GA)、4.5ng/m L TGF-β_1(TGF-β_1处理组,GT)、0.12mg/m L AlCl_3·6H2O和4.5ng/m L T GF-β_1(Al Cl_3+TGF-β_1处理组,GA+T),空白对照组(GC)添加同体积DMEM培养基。检测OB中TGF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4、Smad7、B-ALP和Col I m RNA表达,TGF-β_1和p-Smad2/3蛋白表达,p-Smad2/3/4复合物形成及其入核情况。大鼠体内实验结果如下:(1)染铝组和对照组大鼠股骨、胫骨和4-6腰椎BMD均随染铝时间延长而逐渐增加,染铝120d时,均显著低于对照组(P0.05),说明AlCl_3诱导大鼠骨质疏松模型建立成功。(2)电镜观察发现,骨质疏松大鼠成骨细胞数量减少,细胞膜损伤,细胞核固缩,胞质内线粒体肿胀、嵴不完整、基质溶解呈空泡状,粗面内质网减少、池扩张、断裂、呈空泡化。说明AlCl_3可损伤骨组织中成骨细胞的超微结构,并抑制骨基质的形成。(3)骨质疏松大鼠骨组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)活性均极显著低于对照组(P0.01),丙二醛(MDA)含量极显著高于对照组(P0.01),说明AlCl_3可诱导大鼠骨组织产生氧化应激,造成骨组织氧化损伤。(4)骨质疏松大鼠血清和骨组织中铝含量均显著高于对照组(P0.01);血清和骨组织中钙、磷含量均显著低于对照组(P0.01、P0.05),说明铝可蓄积于骨组织,导致骨组织中钙、磷代谢紊乱。(5)骨质疏松大鼠血清中骨形成标志物B-ALP活性、PINP含量和骨组织中B-ALP m RNA表达量均极显著低于对照组(P0.01);血清中骨吸收标志物TRACP-5b活性和骨组织中TRACP-5b m RNA表达量均显著高于对照组(P0.05),血清中NT X-I含量极显著高于对照组(P0.01);说明AlCl_3可抑制骨形成、增强骨吸收,致使骨转换失衡。(6)骨质疏松大鼠骨组织中TGF-β_1、TβRI、TβRII和Smad4 m RNA表达量均显著低于对照组(P0.05、P0.01),TGF-β_1、p-Smad2/3和p-Smad2/3/4蛋白表达量均显著低于对照组(P0.05),Smad7 mRNA表达量显著高于对照组(P0.05),说明Al Cl_3抑制骨组织中TGF-β_1/Smad信号通路的转导作用。体内实验结果表明,AlCl_3导致骨损伤的同时,TGF-β_1/Smad信号通路转导异常。体外实验结果如下:GA中TGF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4、ALP、Col Im RNA表达量和TGF-β_1、p-Smad2/3、p-Smad2/3/4蛋白表达量均显著低于GC(P0.01),Smad7 m RNA表达量显著高于GC(P0.01);GA+T中TGF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4、ALP、Col ImRNA表达量和TGF-β_1、p-Smad2/3、p-Smad2/3/4蛋白表达量均显著高于GA(P0.01),Smad7 m RNA表达量显著高于GA(P0.01)。说明AlCl_3可抑制OB中TGF-β_1/Smad信号通路的转导作用,进而抑制OB活性和功能;外源TGF-β_1可逆转Al Cl_3对该信号通路和OB的抑制作用。说明Al Cl_3通过抑制TGF-β_1/Smad信号通路的转导而抑制OB的成骨作用。大鼠体内实验和体外OB实验结果说明,AlCl_3通过抑制TGF-β_1/Smad信号通路的转导而诱发骨质疏松。
【关键词】:三氯化铝 大鼠 骨质疏松 成骨细胞 TGF-β_1/Smad信号通路
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R114
【目录】:
  • 摘要8-10
  • Abstract10-12
  • 1 引言12-25
  • 1.1 铝的理化性质及应用12-13
  • 1.2 铝污染来源13-15
  • 1.2.1 饮水中的铝13-14
  • 1.2.2 食品中的铝14
  • 1.2.3 医源性的铝14-15
  • 1.2.4 空气中的铝15
  • 1.3 铝的代谢15-16
  • 1.3.1 铝的吸收与转运15
  • 1.3.2 铝的贮存与分布15-16
  • 1.3.3 铝的排泄16
  • 1.4 铝的毒性16-17
  • 1.5 铝对骨的毒性作用17-22
  • 1.5.1 骨的结构与功能17-18
  • 1.5.2 骨的生长发育18-19
  • 1.5.3 铝对骨脂质过氧化的影响19
  • 1.5.4 骨质疏松症及发病机理19-20
  • 1.5.5 铝对骨形成的影响20-21
  • 1.5.6 铝对骨吸收的影响21-22
  • 1.6 铝对骨质疏松T GF-β_1/Smad信号通路的作用22-24
  • 1.6.1 TGF-β 超家族与Smads家族22
  • 1.6.2 TGF-β_1与骨代谢22-23
  • 1.6.3 TGF-β_1/S mad信号通路与骨质疏松23-24
  • 1.6.4 铝与TGF- β_1/Smad信号通路24
  • 1.7 研究目的和意义24-25
  • 2 材料和方法25-34
  • 2.1 主要仪器和设备25
  • 2.2 主要材料和试剂25-27
  • 2.3 AlCl_3对骨质疏松大鼠TGF-β_1/Smad信号通路的影响27-31
  • 2.3.1 骨质疏松大鼠模型的建立27
  • 2.3.2 样品采集与处理27
  • 2.3.3 检测项目与方法27-31
  • 2.4 AlCl_3对体外培养大鼠OB TGF-β_1/Smad信号通路的影响31-33
  • 2.4.1 大鼠OB培养及处理31-32
  • 2.4.2 检测项目与方法32-33
  • 2.5 试验数据分析及统计33-34
  • 3 结果与分析34-48
  • 3.1 AlCl_3对骨质疏松大鼠TGF-β_1/Smad信号通路影响的结果34-43
  • 3.1.1 大鼠临床症状和体重检测结果34
  • 3.1.2 骨密度检测结果34-35
  • 3.1.3 大鼠骨组织超微结构观察结果35-37
  • 3.1.4 骨组织GS H-Px、SOD活性和MDA含量检测结果37-38
  • 3.1.5 血清和骨组织中铝、钙、磷含量检测结果38-39
  • 3.1.6 血清B- ALP、TRACP- 5b活性和PI NP、NTX-I含量检测结果39-40
  • 3.1.7 骨组织B-ALP、T RACP-5b、T GF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4和Smad7 mRNA表达结果40-42
  • 3.1.8 骨组织TGF-β_1和p-Smad2/3 蛋白表达结果42-43
  • 3.1.9 骨组织p-Smad2/3/4 蛋白入核情况检测结果43
  • 3.2 AlCl_3对体外培养大鼠OB TGF-β_1/Smad信号通路影响的结果43-48
  • 3.2.1 OB中TGF-β_1、TβRI、TβRII、Smad4和Smad7 m RNA表达结果43-45
  • 3.2.2 OB中TGF-β_1和p-Smad2/3 蛋白表达结果45-46
  • 3.2.3 OB中p-Smad2/3/4 蛋白入核情况检测结果46-47
  • 3.2.4 OB中ALP和Col I m RNA表达结果47-48
  • 4 讨论48-54
  • 4.1 AlCl_3诱导骨质疏松大鼠模型的建立48-49
  • 4.2 AlCl_3对大鼠生长发育的影响49
  • 4.3 AlCl_3对大鼠骨组织超微结构的影响49-50
  • 4.4 AlCl_3对大鼠骨氧化与抗氧化功能的影响50
  • 4.5 AlCl_3对大鼠骨钙、磷代谢的影响50-51
  • 4.6 AlCl_3对大鼠骨形成的影响51-52
  • 4.7 AlCl_3对大鼠骨吸收的影响52
  • 4.8 AlCl_3对大鼠TGF-β_1/S mad信号通路的影响52-54
  • 5 结论54-55
  • 致谢55-56
  • 参考文献56-69
  • 附录69-72
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文72

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