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《东北农业大学》 2016年
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猪SP-D检测和真核表达及其对弓形虫基因疫苗免疫增强效应研究

彭永刚  
【摘要】:表面活性蛋白D(SP-D)属于胶原凝集素家族成员,是黏膜上皮细胞分泌的一个模式识别蛋白,其在机体对各种病原体的先天免疫反应中具有重要的作用。大量研究已表明,SP-D可作为多种疾病的生物标记物。为了提高对SP-D表达水平的检测效率,本研究建立了实时荧光定量PCR和金纳米PCR方法。本研究根据猪SP-D mRNA基因序列(nm_214110)设计并合成引物和TaqMan探针,PCR扩增得到猪SP-D基因CDS区序列,并连接pMD-18T载体,构建重组质粒PMD-SP-D作为阳性标准质粒。试验优化了实时荧光定量PCR的反应条件,建立了标准曲线方程:Y=-3.131X+35.09,扩增效率达108%,R2达到0.999,CT值的批内、批间变异系数均小于3%。标准CT值与模板的初始浓度呈良好的线性关系,可以检测到的最低浓度为3copies/μL。在这项研究中还建立了金纳米PCR方法,在优化的反应条件下进行其特异性,灵敏度检测。结果表明,金纳米PCR方法能扩增出与实验设计相一致的特异条带,其敏感性与特异性均优于普通PCR。应用金纳米PCR方法检测猪胸膜肺炎外周血清样品,结果表明金纳米PCR方法可用于临床检测。在建立检测方法的同时本研究构建了含SP-D全基因序列的重组质粒PMD-SP-D,以此为模板,以具有限制性酶切位点Sal I,Hind III的特异性引物PCR扩增了SP-D基因,PCR产物克隆至Sal I/HindⅢ酶切线性化的载体pFast Bac HTb,通过酶切位点和测序鉴定该重组质粒构建成功。将重组载体pFast Bac HTb转化DH10Bac感受态,进行X-gal筛选和PCR验证,结果表明,成功扩增猪SP-D基因,并构建了克隆载体pFast Bac SP-D,重组载体转化成功转化后得到重组Bac-SP-D表达载体,将其转染Sf9细胞后成功表达重组SP-D蛋白。经纯化后得到纯度较高的重组SP-D蛋白,采用SP-D ELISA试剂盒分析结果显示,以杆状病毒为载体的重组SP-D蛋白具有生物活性。该部分实验建立了体外表达具有生物活性的猪SP-D的方法,为研究其在猪体免疫调节中的作用和在疫苗及药物的应用开发奠定了物质基础。多年来,T.gondii基因疫苗已成为T.gondii疫苗研究的热点,但其免疫效率低。研究发现在调节机体固有免疫稳态和记忆T细胞中SP-D与细胞因子发挥了关键作用,为验证SP-D与核酸疫苗共同免疫是否可以提高其疗效,在已验证重组SP-D蛋白具有生物活性的基础上,本研究以表达T.gondii顶端膜抗原1(AMA1)的DNA疫苗PcDNA3.1-AMA1免疫小鼠,采用MTT试验和血清抗体检测对在基因疫苗佐剂PcDNA3.1-SP-D存在或缺乏状况下的免疫反应进行了分析。间接免疫荧光法(IFA)和免疫荧光共聚焦激光扫描显微镜(LSCFM)表明,SP-D可以在体外细胞中表达,且外源蛋白被分散在整个细胞质。采用MTT法检测结果表明,相对PcDNA3.1-AMA1组,PcDNA3.1-SP-D+PcDNA3.1-AMA1组淋巴细胞被诱导的增殖胞反应更显著(P0.05)。AMA1抗体检测表明,Pc DNA3.1-SP-D+Pc DNA3.1-AMA1组AMA1抗体水平增长显著(P0.001)。该试验结果表明了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐剂作用,为T.gondii疫苗免疫及治疗效率提高提供了可行方案,为进一步研究预防和治疗Toxoplasmosis奠定了基础。本研究对微量SP-D mRNA检测提供了两种高效的检测方法,为推广SP-D mRNA作为疾病生物标记物的检测和金纳米粒子PCR的应用提供了实验依据。同时体外表达了具有生物活性的猪SP-D的方法,重组蛋白可以用于研究其在猪体免疫调节中的作用,对重组SP-D蛋白在疫苗和药物的应用开发奠定了基础。本研究首次构建了Pc DNA3.1-SP-D DNA疫苗,并验证了PcDNA3.1-SP-D在T.gondii基因疫苗免疫中的基因佐剂作用,进一步验证了SP-D的免疫增强作用,同时为T.gondii疫苗免疫及治疗效率提高提供了可行方案,为进一步研究预防和治疗Toxoplasmosis奠定了基础。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S858.28

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