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《东北农业大学》 2016年
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组成型表达鸡传染性法氏囊病毒vp2基因重组乳酸菌的构建及免疫原性分析

MAQSOOD IRAM  
【摘要】:传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引发的一种鸡的免疫抑制性传染病,该病给养禽业造成了巨大的经济损失。本研究中,利用乳酸菌表达载体p PG612构建了表达IBDV免疫原性蛋白vp2的重组表达质粒,并分别在L.plantarum,L.pentoses,和L.casei 393三株乳酸菌中进行表达。p PG612载体是一种表面展示载体,该载体中包含HCE组成型启动子和Pgs A锚定蛋白,同时为了提高vp2蛋白的表达量,本研究在该载体中插入了T7g10增强子。本研究对高效制备表达vp2蛋白的阳性重组乳酸菌策略进行了改善,主要评价指标如下:OD600值处于0.4-0.5,重组质粒含量为2μl-6μl(100ng/μl),电压为2.3-2.4 kv/cm。结果显示,有两种重组质粒在三种乳酸菌中均表现出高电转化率,即(i)p PG612-HCE-Pgs A-vp2-rrn BT1T2,(ii)p PG612-HCE-T7g10-Pgs A-vp2-rrn BT1T2,之后的酶切鉴定和PCR鉴定也都均证实了该结果。该方法较之前使用的构建重组乳酸菌的方法更加简单且更加高效。本研究还分别对三株含有p PG612-vp2(p PG612-HCE-Pgs A-vp2-rrn BT1T2)和p PG612-T7g10-vp2(p PG612-HCE-T7g10-Pgs A-vp2-rrn BT1T2)重组质粒的重组乳酸菌作为口服疫苗的免疫原性和针对IBDV的保护率进行了评价。实验结果显示,vp2蛋白成功的获得了表达并展示在各重组乳酸菌的表面,将这些重组乳酸分别命名如下,LPL/p PG612-vp2(PL),LPL/p PG612-T7g10-vp2(TL),LPE/p PG612-vp2(PE),LPE/p PG612-T7g10-vp2(TE),LC/p PG612-vp2(PC)和LC/p PG612-T7g10-vp2(TC)。其中,含有p PG612-T7g10-vp2质粒的重组菌的vp2蛋白表达量较高,说明T7g10增强子能够有效提高vp2蛋白在乳酸菌中的表达水平。动物实验结果显示,口服免疫后,LPL/p PG612-T7g10-vp2株乳酸菌能够刺激机体产生更强的免疫反应以及更高的免疫保护率(87.5%)。通过本研究可以证明,重组乳酸菌系统作为口服疫苗可以刺激动物产生较强的抗体水平,p PG612-HCE-T7g10-Pgs A-vp2-rrn BT1T2免疫组产生的抗体水平显著高于p PG612-HCE-Pgs Avp2-rrn BT1T2免疫组,并且L.plantarum菌株免疫组的免疫保护率高于L.casei免疫组和L.pentoses免疫组。同时,L.casei免疫组的保护率高于L.pentoses免疫组。动物实验中,在vp2免疫组中检测到大量的T细胞,在IBDV攻毒组中也检测到数量增多。与空白对照组相比,所有免疫组的CD4+和CD8+T细胞均显著性增高,其中p PG612-HCE-T7g10-Pgs Avp2-rrn BT1T2免疫组的CD4+和CD8+T细胞比例高于p PG612-HCE-Pgs A-vp2-rrn BT1T2免疫组。TL免疫组中CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为13.3%和21.0%,高于PL免疫组的10.4%和14.0%;TC免疫组CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为11.4%和20.9%,高于PC免疫组的7.2%和11.5%;TE免疫组CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为8.3%和16.7%,高于PE组的7.5%和13.5%。所有免疫组的CD8+T细胞分化率均高于CD4+T细胞。CD8+T细胞属于细胞毒性T细胞,可以裂解感染病毒的细胞、肿瘤细胞和同种异体移植物,在免疫反应中发挥着关键作用。在细胞免疫反应的检测结果中,重组L.plantarum菌株免疫组的CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率高于重组L.casei菌株组和重组L.pentoses菌株组。p PG612-HCE-T7g10-Pgs A-vp2-rrn BT1T2免疫组产生的IFN-γ,IL-2和IL-4细胞因子水平高于p PG612-HCE-Pgs A-vp2-rrn BT1T2免疫组;其它数据显示,IFN-γ水平高于IL-2水平,IL-2水平高于IL-4水平;重组L.plantarum菌株免疫组较其他两个重组菌免疫组能够刺激产生更高水平的Th1和Th2型细胞因子,并且重组L.casei菌株免疫组刺激产生Th1和Th2型细胞因子水平高于重组L.pentoses菌株免疫组。IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子和细胞免疫相关,IL-4等Th2型细胞因子和体液免疫相关。本研究得出结论,含有p PG612-T7g10-vp2质粒的重组L.plantarum乳酸菌免疫原性强,能够针对IBDV提供有效的免疫保护,可作为将来开发IBDV口服疫苗的候选菌株。
【关键词】:传染性法氏囊病毒(IBDV) vp2蛋白 乳酸菌 口服免疫 免疫原性
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65
【目录】:
  • 摘要10-12
  • Abstract12-14
  • 1 Introduction14-21
  • 1.1 Infectious Bursal Disease14-17
  • 1.1.1 Clinical Findings of IBD14-15
  • 1.1.2 VP2 as an antigenic component15-16
  • 1.1.3 Vaccinations progress against IBD16-17
  • 1.2 Lactobacillus an attractive expression system17-19
  • 1.2.1 Bacteriophage T7 gene 10 derived (RBS) translational enhancer17-18
  • 1.2.2 Electro-transformation efficient tool for plasmid DNA uptake18-19
  • 1.3 Advantages of mucosal immunization19
  • 1.4 Objective of this study19-21
  • 2 Materials and Methods21-37
  • 2.1 Materials21-24
  • 2.1.1 Bacterial strains and plasmids21
  • 2.1.2 Virus21
  • 2.1.3 Experimental Animals21
  • 2.1.4 Antibodies and Test Kits21
  • 2.1.5 Primers21-22
  • 2.1.7 Chemical reagents22
  • 2.1.8 Medium and antibiotic22
  • 2.1.9 Instrument and equipment22-24
  • 2.2 Method24-37
  • 2.2.1 Cloning and sequencing of vp2 gene24
  • 2.2.2 Activation of bacteria24
  • 2.2.3 Vp2 gene amplification24-25
  • 2.2.4 Gene extraction and ligation of vp2 with p MD18-T simple vector25-26
  • 2.2.5 Heat shock transformation method26
  • 2.2.6 Screening and identification of recombinant strains26-27
  • 2.2.7 Engineering of expression vector27-30
  • 2.2.8 Preparation of competent cells and bacterial electroporation30-33
  • 2.2.9 Expression of recombinant protein and identification by SDS-PAGE and Western blot33-34
  • 2.2.10 Identification of vp2 surface expression by immunofluorescence34
  • 2.2.11 Propagation of IBDV34-35
  • 2.2.12 Immunization35
  • 2.2.13 Determination of antibody by ELISA35-36
  • 2.2.14 Detection of lymphocytes proliferation36
  • 2.2.15 Statistical analysis36-37
  • 3 Results37-57
  • 3.1 Vp2 amplification and cloning results37-38
  • 3.1.1 PCR amplification result of target vp2 gene37
  • 3.1.2 Recombinant plasmid p MD18-TS-vp2 result37-38
  • 3.1.3 Confirmation result of p MD18-TS-vp2 by single and double digestion38
  • 3.2 Construction and identification result of recombinant expression vector38-44
  • 3.2.1 Engineering of expression vector38-40
  • 3.2.2 Identification of recombinant expression plasmids by enzyme digestion and PCR assay40-42
  • 3.2.3 Electrotransformation result of recombinant expression plasmid into Lactobacillus strains42-43
  • 3.2.4 Comparison of old and improved method43-44
  • 3.3 immunofluorescence results of vp2 surface expression44-47
  • 3.4 SDS-PAGEand Western blot result47-49
  • 3.5 Antibody titire and stimulation of humoral immune response49-51
  • 3.6 Detection of Th1 and Th2 type immune response51-56
  • 3.6.1 Lymphocytes proliferation51-54
  • 3.6.2 Detection of cytokines-based immune response54-56
  • 3.7 Protective efficacy against IBDV challenge56-57
  • 4 Discussion57-62
  • 4.1 Competent cells preparation of Lactobacillus strains57-58
  • 4.2 DNA-based vaccines induce cellular and humoral immune responses58-59
  • 4.3 Expression of vp2 protein on the cell surface using HCE-Pgs A system59
  • 4.4 Comparison of vp2 protein expression using translational enhancer T7g1059-60
  • 4.5 Humoral immune response against IBDV60
  • 4.6 Cellular immune response mediated by T cells60
  • 4.7 Th1 and Th2 cytokines immune responses60-62
  • 5 Conclusions62-63
  • Acknowledgement63-64
  • References64-68
  • Appendix68-70
  • Papers published in the periods of Ph.D. education70

【参考文献】
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