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《东北农业大学》 2016年
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野生大豆GsMIPS2和GsSNAP33基因在盐碱胁迫下的功能分析

Zaib-un-Nisa  
【摘要】:盐碱胁迫是制约植物生长和繁殖的环境因素之一,因此培育具有耐盐碱功能的作物具有重要意义。一般情况下,盐碱胁迫主要破坏细胞内环境的渗透平衡和离子平衡。众所周知,胁迫信号首先通过细胞膜上的受体感知,然后进一步转导至细胞中激活胁迫应答基因,用于调节植物的抗逆性。因此,了解参与胁迫应答基因的耐盐碱分子机制和信号传导通路对作物改良具有重大意义。野生大豆(Glycine soja)较于经过人类长期驯化的其它豆类作物具有更好的适应能力和抗逆性,因此,被认为是挖掘和克隆胁迫抗性基因的重要供体材料。本实验室前期已经完成对野生大豆G07256盐碱胁迫(Na HCO3)下转录组数据的分析。本研究通过生物信息学方法从转录组数据中筛选出两个可能响应盐碱胁迫的候选基因Gs MIPS2和Gs SNAP33,通过分析Gs MIPS2超表达和基因沉默突变体拟南芥植株不同生长阶段盐胁迫下的表型,测定胁迫相关生理指标(MDA,叶绿素含量,电解质外渗),并分析盐碱胁迫下相关基因的表达量,对Gs MIPS2基因的功能进行验证。结果表明,GsMIPS2基因通过保护光合作用系统,稳定胁迫伤害和提高胁迫响应基因的表达量增强了转基因拟南芥的耐盐性。同时,本研究克隆了Gs SNAP33基因的全长序列并对其进行了生物信息学分析,表达模式分析和亚细胞定位分析,并通过在拟南芥中超量表达进行了初步的功能和机理研究。本研究将增加对植物耐盐碱分子机理的理解,并为培育耐盐碱作物提供重要的基因资源,同时也为阐明植物抗逆机制提供了重要的理论基础。结果简要总结如下:1.野生大豆盐碱胁迫应答基因(Gs SNAP33和Gs MIPS2)的克隆和序列分析本研究通过同源克隆方法从野生大豆中克隆盐碱胁迫应答基因GsSNAP33的全长CDS区。Gs SNAP33含有由903碱基组成的开放阅读框(ORF),编码300个氨基酸组成的多肽链,蛋白分子量为33,311Da。Gs MIPS2含有1533碱基组成的开放阅读框(ORF),编码510个氨基酸组成的多肽链,蛋白分子量为56,445Da。序列分析揭示Gs SNAP33基因含有两个保守序列,一是Qb/Qc的亚家族成员的N-末端序列,二是Qc亚家族的的SNARE序列。同样,Gs MIPS2序列分析表明四个高度保守序列GWGGNNG/LWTANTERY/NGSPQNTFVPG和SYNHLGNNDG的存在。2.盐碱胁迫应答基因GsMIPS2和Gs SNAP33基因表达模式的分析通过实时荧光定量PCR实验分析Gs MIPS2基因在盐胁迫条件下的表达模式,结果显示Gs MIPS2基因能够被盐碱胁迫诱导表达,推测Gs MIPS2基因可能参与盐碱胁迫信号传导途径。而Gs SNAP33基因受中性盐、苏打盐、ABA、PEG诱导表达,,且在胁迫条件下,Gs SNAP33基因在根中的表达量显著高于叶中,在中性盐和ABA胁迫下的表达量高于苏打盐或者PEG胁迫,表明Gs SNAP33基因可能也参与盐碱胁迫应答。此外,组织定位分析表明Gs SNAP33基因在种荚、根和种子中表达量较高,而在茎,叶和花中表达量较低。3.Gs SNAP33蛋白的亚细胞定位本研究用绿色荧光蛋白表达系统检测Gs SNAP33蛋白的亚细胞定位情况。构建了含有绿色荧光蛋白的融合表达载体PBSKⅡ-Gs SNAP33-e GFP,并通过基因枪轰击法将融合载体在洋葱表皮细胞中瞬时表达。Gs SNAP33蛋白被发现定位在质膜上,可能在胁迫相关的信号传递过程中具有重要的作用。4.超量表达Gs MIPS2基因在拟南芥中提高了转基因拟南芥不同的生长阶段的耐盐性本研究采用GsMIPS2转基因株系,mips2突变体和野生型拟南芥进行表型分析。通过研究不同生长阶段,包括萌发期、幼苗期和成苗期各个拟南芥株系的耐盐性来阐明GsMIPS2基因的功能。研究结果表明,与野生型和突变体植株相比,Gs MIPS2转基因株系在盐胁迫下萌发率、根长、叶绿素含量显著增加,而MDA含量和电解质外渗水平显著降低,这表明Gs MIPS2转基因株系提高了植物对盐胁迫的耐受性。5.分析了盐碱胁迫响应基因在野生型和超表达拟南芥植株中的表达模式在盐胁迫条件下,与野生型和突变体植株相比,Gs MIPS2超表达株系中一些胁迫应答Marker基因如KINI,RD29A,RD29B,P5CS和COR47的转录水平显著上调。这表明,Gs MIPS2基因在植物响应盐胁迫的过程中可能具有正向调节作用。
【关键词】:野生大豆 拟南芥 GsMIPS2 GsSNAP33 盐胁迫 碱胁迫 功能分析
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q945.78;Q943.2
【目录】:
  • Abstract in Chinese9-11
  • Abstract in English11-14
  • 1 Introduction14-27
  • 1.1 The Purpose and Significance of Study14-15
  • 1.2 Literature Review15-25
  • 1.2.1 Role of Myo-inositol and its Other Derivatives in Plant Growth and Development16-18
  • 1.2.2 Role of MIPS Family Genes in Biotic & Abiotic Stresses18-19
  • 1.2.3 Mutations in MIPS Protein and its Consequences19
  • 1.2.4 SNARE Protein Family: Structure and Housekeeping Functions19-21
  • 1.2.5 t-SNAREs Super family in Plants21-22
  • 1.2.6 Role of SNAP Proteins in Plant Growth and Development22-25
  • 1.3 Main Contents and Technical Plan of Study25-26
  • 1.3.1 The Innovation of Study26
  • 1.4 Objectives of Work26-27
  • 2 Materials and Methods27-36
  • 2.1 Materials27-28
  • 2.1.1 Plant Materials27
  • 2.1.2 Database and Software27
  • 2.1.3 Strains and Plasmids27
  • 2.1.4 Reagents27-28
  • 2.1.5 Culture Medium28
  • 2.1.6 Instruments28
  • 2.2 Methods28-36
  • 2.2.1 Genetic Screening of Gs MIPS2 and Gs SNAP33 Genes Based on Alkali StressResponsive Gene Regulatory Networks28-29
  • 2.2.2 Gene Cloning and Sequence Analysis of Gs MIPS2 & Gs SNAP3329-30
  • 2.2.3 Gs MIPS2 and Gs SNAP33 Gene Expression, Characteristics Analysis under Stressconditions30-32
  • 2.2.4 Tissue Specific Expression Analysis of Gs SNAP33 Gene32
  • 2.2.5 Bioinformatics Analysis of Gs MIPS2 & Gs SNAP3332
  • 2.2.6 Transient Expression and Protein Subcellular localization of Gs SNAP3332-34
  • 2.2.7 Functional Analysis of Gs MIPS234-35
  • 2.2.8 Expression Analysis of Abiotic Stress Related Marker Genes35-36
  • 3 Results36-63
  • 3.1 Functional Analysis of Wild Soybean Gene Gs MIPS2 and its Physiological and MolecularMechanisms under Salt Stress Conditions36-49
  • 3.1.1 Determination of Gs MIPS2 Gene Expression Profile under Salt Stress Conditions36-37
  • 3.1.2 Sequence Analysis of Gs MIPS2 Gene37-39
  • 3.1.3 Identification of the Gs MIPS2 Overexpression OX and atmips2 Plants39-40
  • 3.1.4 Overexpression of Gs MIPS2 Conferred Increased Salt Tolerance at Various GrowthStages of Arabidopsis thaliana40-47
  • 3.1.5 Gs MIPS2 Overexpression Induced Expression of Stress Responsive Genes47-49
  • 3.2 Functional Analysis of Wild Soybean Gene Gs SNAP3349-52
  • 3.2.1 Cloning and Sequence Analysis of Gs SNAP33 Gene49-50
  • 3.2.2 Bioinformatics Analysis of Gs SNAP33 Gene Family50-52
  • 3.3 Determination of Gs SNAP33 Gene Expression Profile under Salt, Alkali, ABA and PEGStress Conditions52-56
  • 3.4 Analysis of Tissue Specific Expression of Gs SNAP33 Gene in Glycine soja56-57
  • 3.5 Generation of Gs SNAP33 Overexpression lines57-60
  • 3.5.1 Construction of Plant Expression Vector57-58
  • 3.5.2 Transformation of p CAMBIA2300-Gs SNAP33 Construct into Arabidopsis by Floral DipMethod58-59
  • 3.5.3 Selection of Gs SNAP33 Overexpressed Lines59-60
  • 3.6 Subcellular Localization Analysis of Gs SNAP33 Protein60-63
  • 4 Discussion63-68
  • 4.1 Diversity of Gs MIPS2 and Gs SNAP33 Genes in Plant Kingdom63-64
  • 4.2 Gs MIPS2 Gene Expression was Identified to be Up-regulated under Salt Stress Conditions5164
  • 4.3 Gs MIPS2 Overexpression Confers Enhanced Salt Tolerance at Various Growth Stages ofArabidopsis thaliana64-65
  • 4.4 Gs MIPS2 Overexpression Alleviates Stress Injuries at Mature Plant Stage65
  • 4.5 Gs MIPS2 Overexpression Results in Up-regulation of Various Abitic Stress-related MarkerGenes65-66
  • 4.6 Gs SNAP33 Gene can be Induced under Salt, Alkali, PEG and ABA Stress Conditions66-67
  • 4.7 Gs SNAP33 is a Plasma Membrane Protein67-68
  • 5 Conclusion68-69
  • Aknowledgement69-70
  • References70-79
  • Papers published in the period of Ph. M. eduction79

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【共引文献】
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