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《东北农业大学》 2016年
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拟南芥OFP1与BLH3、ATH1蛋白互作与相关功能分析

张利国  
【摘要】:拟南芥卵形家族蛋白,即Arabidopsis thaliana Ovate Family Proteins(At OFPs),是一类新的转录调节因子,它能够调控植物多方面的生长和发育。At OFP1是At OFPs家族中的重要一员,也是这个家族中最先被发现的成员,现有研究证明它是一个转录抑制因子,能够通过直接调控其下游的GA合成酶关键基因At GA20ox1的转录,抑制细胞的伸长,但其进一步的功能尚不明确,同时At OFP1本身并没有可以预测的DNA结合域,所以其对靶基因的转录调控需要通过与具有DNA结合域的其它蛋白因子相互作用而实现。转录因子家族TALE同源结构域蛋白,即Three-aa Loop Extension(TALE)homeodomain protein,就是一类已知的At OFP1潜在的互作蛋白,BLH类蛋白和KNOX蛋白同属于TALE类转录因子。目前,通过对TALE类蛋白的分子遗传学研究,已知其在植物发育过程中具有一些明确的形态调节功能,如决定叶片的形状,控制植株花茎的生长和发育,以及调控营养生长到生殖生长的转变等,因此,AtOFP1可能通过与TALE类蛋白的互作在拟南芥的形态与发育中发挥重要的调控作用。本研究通过定向酵母双杂交、免疫共沉淀和双分子荧光互补等方法,从多个角度确定了OFP1能够在体内与BLH3、ATH1发生蛋白互作,同时进一步确定了BLH3、ATH1与OFP1发生蛋白互作的结构域,然后通过原生质体瞬时转染试验明确了BLH3、ATH1的转录活性,并确定其转录活性结构域,其次明确了BLH3、ATH1基因在拟南芥中的表达特点,并基于相关基因突变体以及不同遗传背景下的基因过表达体植株表型分析,阐述了OFP1-BLH3复合物和OFP1-ATH1复合物在调节植物生长发育过程中的相关功能,明确了OFP1与BLH3、ATH1的相互依赖关系,以及OFP1在OFP1-BLH3复合物和OFP1-ATH1复合物中的作用和角色,最后,Realtime-PCR试验结果表明,OFP1和ATH1对赤霉素合成基因At GA20ox1与开花抑制基因FLC的表达可能均具有调控作用。研究将为进一步明确OFP以及TALE-OFPs复合物在植物发育过程中的调节功能提供分子基础,对植物重要性状的遗传改良具有积极的指导意义。主要试验结果如下:(1)OFP1与BLH3、ATH1在体内互作分别形成一个蛋白复合物。通过酵母双杂交证实OFP1能够与BLH3、ATH1发生蛋白相互作用,通过免疫共沉淀和双分子荧光互补进一步确定了这种相互作用。同时,OFP1与含有BLH3、ATH1不同结构域的蛋白区段互作表明,BLH3和ATH1均是通过Homeodomain结构域与OFP1发生蛋白互作的。(2)确定BLH3、ATH1的转录活性与转录活性结构域。原生质体瞬时转染试验结果表明,与对照相比BLH3激活GUS报告基因的表达量相对较高,是一个转录激活因子,ATH1与对照相比激活GUS报告基因的表达量相对较低,是一个转录抑制因子;含有不同BLH3、ATH1结构域的蛋白区段转染试验结果表明,BLH3的转录激活域主要位于含有SKY-BELL结构域的blh3的n端,ath1的转录抑制域同样位于含有sky-bell结构域的ath1的n端,此蛋白区段含有一个转录抑制的motif,即lxlxl。(3)ofp1能够负调节blh3蛋白转录激活活性,ofp1能够增强ath1蛋白的转录抑制活性。瞬时转染结果表明,相比单独转染blh3,共同转染ofp1和blh3时,gus报告基因表达量出现明显降低,同时,由于过去的研究曾报道,blh3还可能与knox类蛋白互作,因此,ofp1能够负调节blh3或者blh3-knox蛋白复合物,降低其转录活性;同时,相比单独转染ath1,共同转染ofp1和ath1时,gus报告基因的表达量进一步降低,说明ofp1能够增强ath1或者可能的ath1-knox蛋白复合物的转录抑制活性。(4)ofp1与blh3、ath1具有相似的时空表达性,可能存在于同一细胞类型中。blh3prom:blh3的gus表达和rt-pcr表达结果显示,blh3有和ofp1相类似的表达模式,包括叶、胚轴、近根部、根尖、花茎以及花。同时,ath1prom:ath1的gus表达和rt-pcr结果显示,尽管ath1与ofp1在相同时空中的表达部位和表达量有着一定差异,但总体上具有相类似的表达模式,包括叶、胚轴、近根部、根尖、花茎以及花,试验结果表明ofp1蛋白和blh3、ath1蛋白可能处于同一细胞类型中。因此,ofp1与blh3、ath1的蛋白互作是具有生物学意义的。(5)ofp1–blh3蛋白复合物的功能。35s:ofp1株系,35s:blh3株系,ofp1株系,blh3株系,35s:ofp1/blh3株系,35s:blh3/ofp1株系的形态学分析表明,ofp1-blh3蛋白复合物能够调节植物从营养生长到生殖生长的转变时间,blh3能够促进这种转变而不是抑制它,ofp1能够降低blh3这种促进转变的能力。同时,35s:ofp1/blh3株系与35s:ofp1株系相比,虽然其表型并未得到有效抑制,但是35s:ofp1/blh3株系的开花时间与叶片数量更接近于野生型,说明ofp1在调节植株从营养生长到生殖生长的转变时间上,可能部分的依赖blh3去作用。(6)ofp1–ath1蛋白复合物的功能。35s:ofp1株系,35s:ath1株系,ofp1株系,ath1株系,35s:ofp1/ath1株系,35s:ath1/ofp1株系的形态学分析表明,ofp1–ath1复合物能够调节植物从营养生长到生殖生长的转变时间,但与blh3不同,ath1能够抑制这种转变而不是促进它,ofp1能够进一步增强ath1这种抑制能力。同时,ofp1–ath1复合物能够调节植物茎的伸长与花基底边界的形成。试验结果表明,相对野生型,ath1/ofp1株系与ofp1/ath1株系均出现不同程度的茎高降低的表型,同时,35s:ath1株系的茎高低于ath1/ofp1的茎高(p-values小于0.05),从形态学上证实了瞬时转染的结果,即ofp1能够增强ath1的转录抑制能力。ofp1株系与ath1株系均表现出花基底边界出现不同程度融合的性状,并且ofp1能够与ath1在体内发生互作,且都作为转录抑制因子发挥调节作用,暗示ofp1-ath1复合物可能处于共同的通路中调节植物花基底边界的形成。此外,ofp1-ath1可能参与调控atga20ox1与flc。通过realitime分析相关基因的表达量,试验结果表明,ofp1与ath1对赤霉素合成的一个关键酶基因atga20ox1的表达可能均具有调控作用;同时,ATH1和OFP1的表达量在短日照到长日照转变过程中均出现下调;此外,35S:ATH1株系和35S:OFP1株系的FLC(开花抑制基因)表达量均下调。
【关键词】:拟南芥 OFP1 蛋白互作 BLH3 ATH1
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q943.2
【目录】:
  • 摘要10-13
  • 英文摘要13-17
  • 1 引言17-34
  • 1.1 拟南芥OFP家族研究概述17-25
  • 1.1.1 拟南芥OFP家族研究进展17-18
  • 1.1.2 At OFP1靶基因筛选与子叶发育调节18-20
  • 1.1.3 At OFP1与Ku蛋白互作调节DNA损伤修复20
  • 1.1.4 At OFPs与KNAT7蛋白互作调节植物次生细胞壁的形成20-23
  • 1.1.5 BLH家族和KNOX家族概述23
  • 1.1.6 拟南芥OFP家族与BLH家族和KNOX家族互作分析23-25
  • 1.2 蛋白互作研究方法概述与进展25-28
  • 1.2.1 酵母双杂交技术25-26
  • 1.2.2 双分子荧光互补(Bi FC)26
  • 1.2.3 免疫共沉淀(Co-IP)和pull down26-28
  • 1.3 拟南芥FLC基因作用机理与研究进展28-29
  • 1.3.1 FLC蛋白的结构特征28
  • 1.3.2 FLC蛋白的作用机制28-29
  • 1.3.3 影响FLC蛋白调控的因素29
  • 1.4 赤霉素(GA)功能与研究进展29-31
  • 1.4.1 GA的发现、结构与合成30
  • 1.4.2 赤霉素的信号转导研究30
  • 1.4.3 GA与其它激素及环境因子的互作30-31
  • 1.5 本研究的目的、意义及技术路线31-34
  • 1.5.1 研究的目的意义31-33
  • 1.5.2 技术路线33-34
  • 2 材料与方法34-42
  • 2.1 试验材料34
  • 2.2 本试验涉及使用的主要仪器设备34
  • 2.3 BLH3和ATH1基因的克隆与载体构建34-36
  • 2.4 质粒构建和酵母双杂交检测蛋白互作关系36-37
  • 2.5 双分子荧光互补试验(Bi FC)37
  • 2.6 原生质体转化和蛋白提取37-38
  • 2.7 提取酵母质粒鉴定互作基因38
  • 2.8 原生质体瞬时转染与相关质粒构建38-39
  • 2.9 反转录PCR和GUS表达分析39
  • 2.10 Real-time PCR分析39-40
  • 2.11 免疫共沉淀(Co-IP)40
  • 2.12 扫描电镜40-41
  • 2.13 杂交实验41-42
  • 3 结果与分析42-77
  • 3.1 酵母双杂交测试OFP1与BLH3之间的蛋白互作42
  • 3.2 通过酵母双杂交分析BLH3与OFP1发生相互作用的结构域42-46
  • 3.3 通过酵母双杂交测试ATH1与OFP1相互作用46
  • 3.4 通过酵母双杂交分析ATH1与OFP1发生相互作用的结构域46-50
  • 3.5 通过Bi FC分析OFP1与BLH3之间的蛋白相互作用50-51
  • 3.6 通过Bi FC分析OFP1与ATH1之间的蛋白相互作用51-52
  • 3.7 免疫共沉淀(Co-IP) 分析OFP1与BLH3之间的相互作用52
  • 3.8 免疫共沉淀(Co-IP) 分析OFP1与ATH1之间的相互作用52-53
  • 3.9 BLH3转录活性测试及OFP1对其转录活性的调节分析53-55
  • 3.10 BLH3转录激活域分析55-56
  • 3.11 ATH1转录活性测试及OFP1对其转录活性的调节分析56-58
  • 3.12 ATH1转录抑制域分析58-60
  • 3.13 BLH3基因在拟南芥中的表达60-61
  • 3.14 ATH1基因在拟南芥中的表达61
  • 3.15 BLH3-OFP1互作调控拟南芥从营养生长到生殖生长的转变61-66
  • 3.15.1 blh3突变体的鉴定与表型分析61-62
  • 3.15.2 不同遗传背景材料的性状分析62-66
  • 3.16 OFP1在ATH1-OFP1中的调节功能66-77
  • 3.16.1 ath1突变体的鉴定与表型分析66-67
  • 3.16.2 参与调节茎的伸长、开花时间67-72
  • 3.16.3 相关基因的Realtime-PCR分析72-76
  • 3.16.4 OFP1-ATH1复合物对花基边界的调控76-77
  • 4 讨论77-86
  • 4.1 OFP-BLH-KNOX蛋白互作网络77-79
  • 4.2 OFP1与BLH3在体内的蛋白互作79-80
  • 4.3 BLH3-OFP1调控营养生长到生殖生长的转变时间80-81
  • 4.4 OFP1在OFP1-ATH1蛋白复合物中的作用81-82
  • 4.5 ATH1的抑制结构域82-83
  • 4.6 ATH1-OFP1调控拟南芥茎的生长、开花时间及花基边界83-86
  • 5 结论86-88
  • 5.1 OFP1与BLH3互作调控营养生长到生殖生长的转变时间86
  • 5.2 OFP1与ATH1互作调控茎的生长、开花时间及花基边界86-88
  • 6 创新点88-89
  • 7 下一步工作设想89-90
  • 致谢90-91
  • 参考文献91-104
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文104

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 桂蓓;王瑛;;烟草ovate同源基因的全长cDNA克隆与序列分析[J];植物生理学通讯;2007年06期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 邱志刚;小麦DREB/ERF转录因子相互作用蛋白质的筛选与验证[D];中国农业科学院;2010年
2 宋林霞;利用酵母双杂交系统筛选与G蛋白及CaM相互作用的新蛋白[D];河北师范大学;2003年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 李宏铃;黄建平;;植物OVATE蛋白分析(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年04期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 张利国;拟南芥OFP1与BLH3、ATH1蛋白互作与相关功能分析[D];东北农业大学;2016年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 ;国家重点基础研究发展规划项目:水稻重要性状的功能基因组学研究项目简介[J];植物学报;2001年07期
【相似文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 张利国;拟南芥OFP1与BLH3、ATH1蛋白互作与相关功能分析[D];东北农业大学;2016年
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相关作者
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