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《东北农业大学》 2016年
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表达Anhinga株HN基因嵌合病毒的构建及其抗肿瘤效果的研究

何金娇  
【摘要】:新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)为单股不分节段的负链RNA病毒,属副粘病毒科、禽副粘病毒属。19世纪20年代,有研究报道NDV能杀伤肿瘤细胞,1964年,NDV首次被用于癌症的治疗,从此NDV作为一种潜在的肿瘤治疗生物制剂引起了人们的关注,成为肿瘤研究领域的热点之一。根据该病毒对易感动物鸡的致病力将NDV分为强毒株、中毒株和弱毒株。强毒株溶瘤效果好,但对生态造成威胁,影响养禽业的发展;弱毒株对生物环境友好,对家禽没有致病作用,但溶瘤效果较差。选择什么样的毒株作为肿瘤治疗制剂一直是该研究领域难以决定的重大问题。最理想的选择是提高弱毒株的溶瘤效果,而不改变病毒的毒力。以往的研究表明NDV的F基因是决定病毒溶瘤效果的关键基因,但是F基因的溶瘤效果与病毒的毒力密切相关。多项研究结果显示,当使用强毒株的F基因替换弱毒株的F基因时,NDV溶瘤活性增加,但是同时受体病毒的毒力大幅度提高,甚至可以达到强毒株的毒力。这些结果排除了用F基因提高弱毒株溶瘤效果的可能性。最近美国东南禽病研究所Qingzhong Yu团队报道了NDV Anhinga毒株的HN基因的突变显著提高了该病毒形成合胞体的能力,说明除F基因外,HN基因可能也是决定病毒溶瘤效果的重要因素。NDV的HN蛋白是一个多功能蛋白,其在病毒的感染过程中扮演着十分重要的角色。HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性,可以识别细胞表面的唾液酸受体从而促进F蛋白的融合作用。但是,HN基因引起溶瘤效果与病毒致病力的关系还未见报道。本研究旨在用中毒Anhinga的HN基因替换弱毒株Clone30的HN基因,观察是否能提高弱毒株的溶瘤效果、如能提高弱毒株的溶瘤效果,是否增加弱毒株的对易感动物的致病力,为研制安全、有效(即提高NDV的溶瘤效果,而保持弱毒株的安全性)的溶瘤病毒制剂奠定理论基础。为了在DNA水平置换中毒株Anhinga的HN基因,本研究首先应用反向遗传操作技术克隆弱毒株Clone30的全长基因组。采取了“分段克隆”的策略。在构建c DNA克隆时,将NDV Clone30全基因组分成部分重叠的十个片段,利用重叠部分的酶切位点将这十个片段依次克隆到低拷贝质粒PFLC中,并在基因组3523bp、12357bp位置上进行定点突变,作为分子标签用于鉴定拯救出的病毒。本实验采取的是不依赖于辅助病毒的完全质粒操作系统,并使用稳定表达T7聚合酶的BHK-21细胞作为转染细胞。拯救获得的重组病毒通过鸡胚进行增殖并收集尿囊液进行后续实验,重组病毒命名为新城疫r Clone30。然后用中毒株Anhinga(Anh)的HN基因替换了弱毒株Clone30的HN基因,构建了重组嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。首先将HN基因的PCR产物亚克隆入感染性克隆p Clone30载体,与辅助质粒NP、P和L共同转染BHK-21细胞,37°C培养72h后,于-80°C冻融三次收取细胞上清,接种9-11日龄的SPF鸡胚。继续培养72h后,收获得鸡胚尿囊液,即为嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。对嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的生物学特性分析显示,嵌合病毒和亲本毒株具有相同的生长动力学曲线,即HN基因的替换并没有影响Clone30的复制。嵌合病毒的HA效价(24)低于亲本毒株Clone30(29)与供体株Anh相似(24)。同时,与亲本毒株相比嵌合病毒在引起细胞融合的能力上明显增强,表现在嵌合病毒感染的HepG2细胞单层中产生较大的合胞体。对嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)的毒力和致病力分析显示,r Clone30-Anh(HN)与亲本毒株在半数组织培养感染量(TCID50=3.95×107)、平均死亡时间(MDT120h)和鸡胚半数感染量(EID50=1.8×108)上没有显著区别。嵌合病毒脑内致病指数(ICPI)为0.08略高于亲本毒株(ICPI=0),但仍属于弱毒株(ICPI=0-0.5)。实验结果表明HN基因的替换没有对Clone30毒力和致病力造成明显的影响。在细胞水平上,对嵌合病毒rClone30-Anh(HN)抑制肿瘤能力进行分析。MTT结果显示与亲本毒株相比,rClone30-Anh(HN)表现出对人肝癌细胞HepG2更为显著的细胞毒性作用。通过对两种病毒感染的Hep G2细胞进行AnnexinV-PI检测、Rhodamine123染色和Caspase3基因转录水平分析,结果表明HN基因的替换显著提高了嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)诱导肿瘤细胞凋亡的能力。利用两种病毒对鼠源肝癌H22荷瘤小鼠进行治疗,结果表明与亲本毒株相比r Clone30-Anh(HN)治疗组的小鼠肿瘤体积明显缩小,肿瘤病理切片显示该治疗组的肿瘤内出现了较为严重的T细胞浸润和坏死。实验证明HN基因的替换提高了Clone30株在体内的抑瘤效果。综上所述,本研究构建了表达中毒株Anhinga的HN基因的重组弱毒株Clone30嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)。该嵌合病毒在毒力和致病性与亲本毒株相似,但显著提高了嵌合病毒的抑瘤活性。这些结果为研制溶瘤效果好,致病力低,安全有效的溶瘤病毒提供了一个崭新的思路。同时得到的嵌合病毒rClone30-Anh(HN)有望取代亲本病毒Clone30株,成为新一代溶瘤病毒载体应用于肿瘤的治疗。
【关键词】:Anhinga株 HN基因 嵌合病毒 抑瘤活性
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S852.65;R73-36
【目录】:
  • 摘要12-14
  • 英文摘要14-17
  • 1 前言17-25
  • 1.1 研究背景17
  • 1.2 溶瘤病毒17-18
  • 1.3 新城疫病毒18-19
  • 1.4 NDV的溶瘤特性19
  • 1.5 病毒进入蛋白:主要毒力因子19-23
  • 1.6 NDV毒力的测定23
  • 1.7 本研究的目的与意义23-25
  • 2 材料25-28
  • 2.1 病毒株、细胞株和质粒25
  • 2.2 鸡胚、鸡血和实验动物25
  • 2.3 细胞培养基及生化试剂25
  • 2.4 引物25-27
  • 2.5 主要仪器和设备27-28
  • 3 方法28-42
  • 3.1 NDV Clone30基因组的克隆与序列分析28-30
  • 3.1.1 NDV Clone30全长cDNA的扩增28
  • 3.1.2 PCR产物的回收28-29
  • 3.1.3 PCR回收产物与克隆载体的连接29
  • 3.1.4 阳性克隆的筛选29
  • 3.1.5 阳性重组质粒的鉴定29-30
  • 3.1.6 NDV病毒基因组重叠片段c DNA序列测定与结果分析30
  • 3.2 NDV全长CDNA克隆转录质粒的构建30-31
  • 3.3 S片段、HN片段和B片段的克隆31-33
  • 3.3.1 S片段的PCR扩增31-32
  • 3.3.2 S片段的PCR产物的纯化与回收32
  • 3.3.3 HN片段的PCR扩增32
  • 3.3.4 HN片段的PCR产物的纯化与回收32-33
  • 3.3.5 B片段的PCR扩增33
  • 3.3.6 B片段的PCR产物的纯化与回收33
  • 3.4 S-HN片段的克隆33-34
  • 3.4.1 S-HN片段的PCR扩增33-34
  • 3.4.2 S-HN片段的PCR产物的纯化与回收34
  • 3.4.3 p MD-S-HN阳性重组质粒的鉴定34
  • 3.5 S-HN-B片段克隆与序列分析34-35
  • 3.5.1 S-HN-B片段的PCR扩增34-35
  • 3.5.2 S-HN-B片段的PCR产物的纯化与回收35
  • 3.5.3 p MD-S-HN-B阳性重组质粒的鉴定35
  • 3.6 表达Anh株HN基因的重组病毒rClone30-Anh(HN)基因组全长CDNA的构建35-37
  • 3.6.1 S-HN-B片段与重组NDV病毒基因组转录载体片段的制备35-36
  • 3.6.2 S-HN-B基因片段与重组NDV病毒基因组转录载体片段的连接36
  • 3.6.3 重组质粒的鉴定36-37
  • 3.7 重组NDV的拯救37
  • 3.7.1 嵌合病毒r Clone30-Anh(HN)的拯救37
  • 3.7.2 亲本病毒r Clone30的拯救37
  • 3.8 拯救病毒的生长动力学曲线的测定37-38
  • 3.9 DAPI染色分析嵌合病毒的促融合作用38
  • 3.10 拯救病毒的滴度、毒力及致病力的测定38-39
  • 3.10.1 嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的滴度测定38
  • 3.10.2 嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的毒力测定38-39
  • 3.10.3 嵌合病毒rClone30-Anh(HN)的致病力测定39
  • 3.11 MTT法检测嵌合病毒对肿瘤细胞的抑制作用39
  • 3.12 Annexin V-PI法检测嵌合病毒对肿瘤细胞的杀伤效果39-40
  • 3.13 FACS分析检测细胞线粒体膜电位40
  • 3.14 实时荧光定量PCR检测Caspase3基因的mRNA表达水平40
  • 3.15 肿瘤动物模型的建立40
  • 3.16 嵌合病毒对昆明小鼠H22肝癌动物模型的治疗40-41
  • 3.17 肿瘤组织病理切片的制作41
  • 3.18 统计学分析41-42
  • 4 实验结果42-82
  • 4.1 病毒基因组CDNA的PCR扩增与酶切鉴定42-52
  • 4.1.1 F1cDNA的PCR扩增与酶切鉴定42
  • 4.1.2 F2cDNA的PCR扩增与酶切鉴定42-44
  • 4.1.3 F3cDNA的PCR扩增与酶切鉴定44-45
  • 4.1.4 F4cDNA的PCR扩增与酶切鉴定45-46
  • 4.1.5 F5cDNA的PCR扩增与酶切鉴定46-47
  • 4.1.6 F6cDNA的PCR扩增与酶切鉴定47-48
  • 4.1.7 F7cDNA的PCR扩增与酶切鉴定48-49
  • 4.1.8 F8cDNA的PCR扩增与酶切鉴定49-50
  • 4.1.9 F9cDNA的PCR扩增与酶切鉴定50-51
  • 4.1.10 F10cDNA的PCR扩增与酶切鉴定51-52
  • 4.2 序列测定结果分析52-53
  • 4.3 NDV全长CDNA克隆载体的构建53-63
  • 4.3.1 F1, F2, F3的连接53
  • 4.3.2 F3, F4的连接53-55
  • 4.3.3 F4, F5, F6的连接55-57
  • 4.3.4 F3, F4, F5, F6的连接57-58
  • 4.3.5 F6, F7, F8的连接58
  • 4.3.6 F8, F9的连接58-60
  • 4.3.7 F9, F10的连接60-61
  • 4.3.8 F8, F9, F10的连接61-63
  • 4.4 S片段、HN片段和B片段的克隆63-66
  • 4.4.1 S片段的PCR扩增63
  • 4.4.2 S片段的PCR产物的纯化与回收63-64
  • 4.4.3 HN片段的PCR扩增64
  • 4.4.4 HN片段的PCR产物的纯化与回收64-65
  • 4.4.5 B片段的PCR扩增65
  • 4.4.6 B片段的PCR产物的纯化与回收65-66
  • 4.5 S-HN片段的克隆66-67
  • 4.5.1 S-HN片段的PCR扩增66
  • 4.5.2 S-HN片段的PCR产物的纯化与回收66
  • 4.5.3 p MD-S-HN阳性重组质粒的鉴定66-67
  • 4.6 S-HN-B片段的克隆67-69
  • 4.6.1 S-HN-B片段的PCR扩增67-68
  • 4.6.2 S-HN-B片段的PCR产物的纯化与回收68-69
  • 4.6.3 p MD-S-HN-B阳性重组质粒的鉴定69
  • 4.6.4 S-HN-B片段的序列测定与分析69
  • 4.7 重组NDV p Clone30-Anh(HN)基因组载体的构建和阳性重组质粒的鉴定69-70
  • 4.7.1 S-HN-B片段和p Clone30载体片段的制备69-70
  • 4.7.2 阳性重组质粒的鉴定70
  • 4.8 嵌合病毒的生长动力学测定70-72
  • 4.9 DAPI染色分析嵌合病毒的促融合作用72-73
  • 4.10 嵌合病毒的滴度、毒力及致病力的测定73-74
  • 4.11 MTT法检测嵌合病毒对人Hep G2细胞的抑制作用74-75
  • 4.12 Annexin V-PI法检测嵌合病毒对人Hep G2细胞的杀伤效果75-76
  • 4.13 FACS分析细胞线粒体膜电位76-77
  • 4.14 Caspase3 mRNA水平的检测77-78
  • 4.15 嵌合病毒对昆明小鼠H22肝癌动物模型的抑制作用78-80
  • 4.16 嵌合病毒治疗后的肿瘤组织切片的观察80-82
  • 5 讨论82-86
  • 5.1 NDV治疗肿瘤的前景82
  • 5.2 低致病力、高溶瘤活性是理想的NDV抗肿瘤制剂82-83
  • 5.3 中毒株HN基因增加了弱毒株的溶瘤活性,保持了弱毒株的致病力83-86
  • 6 结论86-87
  • 致谢87-88
  • 参考文献88-97
  • 附录A97-102
  • 附录B102-107
  • 附录C107-108
  • 附录D108-109
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文109

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