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《东北农业大学》 2016年
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三倍体虹鳟卵巢败育的调控机制研究

徐革锋  
【摘要】:虹鳟(Onchorynchus mykiss),属于鲑形目(salmoniformes),鲑科(salmonidae),大麻哈鱼属(Oncorhynchus)。该鱼是FAO向世界推荐的高品质养殖对象之一,也是我国最主要的鲑鳟鱼引进品种和养殖对象。由于三倍体雌性虹鳟在鲑鳟鱼养殖业中显示了诸多优点,如性腺不发育、肌肉品质好等。因此,以全雌三倍体虹鳟作为鲑鳟鱼养殖业发展的主力品种已成为大势所趋。众所周知,鲑科鱼类即便多出一套甚至两套染色体也能够生存和繁殖,这是其他脊椎动物不具有的特性。四倍体和雄性三倍体虹鳟与二倍体虹鳟性腺具有相同结构与功能,然而,三倍体雌性虹鳟是一个例外,早期卵巢呈线状,并且缺少初级卵母细胞。因此,三倍体虹鳟的性别分化与发育机制之间的本质区别成为了研究焦点。尽管与性别决定和分化的相关基因在二倍体虹鳟中已被鉴定出来,如sdY、Dmrt1、Cyp19a1a、Foxl2和Sox9等,但关于三倍体雌性虹鳟独特性腺表型及其相关性别控制基因的表达规律仍未得到深入研究,尤其是早期卵巢发育阻滞导致的生殖细胞去分化特征。因此,本研究以三倍体雌性虹鳟性腺发育中起重要调控作用的特异候选基因作为重点研究对象,辅助性腺体细胞与生殖细胞分化方向的组织学证据和类固醇激素表达规律,并通过外源性激素诱导,对三倍体雌性虹鳟的性腺表型发育进行预期调控,验证各基因间的级联调控关系以及与性细胞重塑和性类固醇激素消长规律间的互作效应,揭示雌性三倍体虹鳟卵巢败育及其天然性转变的发生机制与调控机理。主要研究结果如下:(1)虹鳟三倍体与二倍体卵巢的分化特征基本一致。虹鳟二倍体与三倍体性腺分别在84dpf和98 dpf就已分化为卵巢。但三倍体虹鳟卵巢分化存在障碍,早期发育停滞,卵原细胞及其滤泡细胞数量有限。在154~574 dpf时期,二倍体虹鳟卵巢中充满卵母细胞,而三倍体卵巢缺少相当数量卵母细胞,卵巢呈线状,且在之后的发育期里一部分雌性生殖细胞开始去分化。在964 dpf时期,雌性三倍体性腺发生组织重构,并出现再分化现象,性腺中有类似于产精子样细胞囊存在,这些细胞显得比卵原细胞略小,与二倍体精巢分化早期生殖细胞相似。(2)在334~964 dpf时期,二倍体两性虹鳟血清中雌二醇和睾酮含量均呈逐渐升高的趋势变化,雌性血清雌二醇含量为50~650 pg/ml,较雄性高5~8倍;雄性血清睾酮含量为20~180ng/ml,较雌性高10~25倍。雌性三倍体虹鳟血清雌二醇含量呈先升高后降低趋势变化,但其含量始终没能达到二倍体水平,峰值为110 pg/ml(574 dpf);雌性三倍体睾酮含量呈逐渐升高趋势变化,在发育后期几乎达到了二倍体雄性水平。随着雌性三倍体虹鳟性腺发育,卵巢退化较为严重,导致雌激素代谢通路受阻,当精巢支持细胞出现,睾酮被转化为雌二醇的量大大降低。(3)在154~964 dpf时期,分别以二倍体雌、雄虹鳟作为同期基础对照,采用RT-PCR技术对雌性三倍体虹鳟性腺特异基因进行差异化表达分析。研究结果表明,除Dax1外,在二倍体和三倍体虹鳟性腺中均获得了Cyp19a1a、Foxl2、sdY、Dmrt1、Amh和Sox9的表达谱。在雌性三倍体虹鳟性腺中,Cyp19a1a和Foxl2表达量均呈先升高后降低趋势,并显著低于在二倍体卵巢中的表达水平(p0.05),只有在154~574dpf时期,这两个基因表达量显著上调(p0.05),但他们在整个发育期都显著高于在二倍体精巢中的表达水平(p0.05);sdy和dmrt1表达量均呈先升高后降低趋势变化,amh和sox9表达量均呈逐渐上调趋势,这些基因在574~964dpf时期均显著高于在二倍体卵巢中的表达水平(p0.05)。在发育早期,雌性三倍体虹鳟sdy和dmrt1表达量显著低于在二倍体精巢中的水平(p0.05),但在574dpf时期他们的表达量达到最高,且sdy表达量显著高于二倍体雄性水平(p0.05);尽管在574~964dpf时期,amh和sox9的表达量较二倍体雌性虹鳟高数百倍,但他们的表达仍极显著低于在二倍体精巢中的水平(p0.05)。因此,本研究认为,cyp19a1a和foxl2不断被下调或抑制,是导致雌性三倍体卵巢败育主要因素之一。(4)三倍体雌性虹鳟经历了卵巢发育停滞、性腺结构重组和性转变过程。在幼鱼期,三倍体雌性虹鳟血清雌二醇含量最高,且foxl2和cyp19a1a表达量持续上调,而sdy、dmrt1、amh和sox9表达量均相对较低,血清睾酮含量也处于较低水平。但随着进入成年期发育(784~964dpf),仅靠雌激素已无法诱导foxl2持续高表达,而cyp19a1a的表达水平也随之急剧下调;该时期sdy、amh和sox9均持续高表达,sdy甚至达到了同期二倍体雄性的表达水平,而foxl2和cyp19a1a表达急剧下调直至微量表达。(5)本研究是第一次在三倍体雌性虹鳟上设计实验,外源性雄激素和雌激素采用虹鳟养殖业中的通常剂量。芳香化酶抑制剂(1,4,6-androstatriene-3,17-dione,atd)处理成功诱导了精巢分化,其发育模式与二倍体雄性的趋于一致,但精巢发育速度较慢,不过没影响其自然生理应答。17α-甲级睾丸酮(17α-methyltestosterone,met)处理不但没能产生雄性化诱导效应,还将遗传为雌性的性腺始终抑制在低分化水平,严重阻碍了性腺向任何一个方向发展的可能。因此本研究认为,三倍体化改变了雌性虹鳟自身雄性化诱导通路的作用机制。atd诱导与性腺重构的双重作用触发了雌性向雄性逆转,而之后进入精巢发育模式。在三倍体虹鳟卵巢去分化和再分化期进行雌激素回救处理,并不能有效促进或维持卵巢发育。(6)本研究依据雌-雄性转化生物模型来了解三倍体雌性虹鳟的性腺分化特点及其候选基因表达谱,探索当基因组被放大后,雄性化处理对某些在二倍体中微量表达的基因的影响效应,验证性腺特异基因在卵细胞发生去分化和再分化过程中的调控机制。通过总体表达谱可知,在整个发育过程中cyp19a1a和foxl2的表达均被atd所抑制,甚至在发育后期这两个典型的雌性基因也没能得到有效恢复。由于雌性基因不断被下调或抑制,导致了卵巢败育,并使卵细胞去分化返回到性原细胞时期;随着sdy和dmrt1表达量不断上调,激活了性原细胞再分化为雄性生殖细胞,并在sox9和amh协同作用下,开启了精巢分化模式。met在三倍体雌性分化过程中不具有对cyp19a1a和foxl2的抑制效应,反而是对其产生了增量调节,尽管同时也上调了其他雄性特异基因,但由于雌性分化通路并未被完全破坏,导致了雄性化处理失败。在雌性三倍体性腺去分化和再分化时期,外源性雌二醇处理破坏了foxl2与cyp19a1a级联调控关系,并始终抑制cyp19a1a表达。由于滤泡层退化或消失,雌性基因绝对数量骤减,进而导致内源性雌激素合成不足。由于原本cyp19a1a表达量就处于较低水平,再加之外源性雌激素强烈抑制,加剧了卵细胞的去分化进程,甚至在再分化期外源性雌激素有促进雄性特异基因表达的情况。说明雌性分化通路中雌激素与foxl2和cyp19a1a之间确实存在反馈调控关系。综上所述,本研究得到以下结论:(1)三倍体虹鳟卵巢分化同样由cyp19a1a与foxl2共同参与启动,而且受雌激素调控较为明显;在其卵巢败育时期,sd Y和Dmrt1联合调控作用将导致雌性化通路的Cyp19a1a与Foxl2的表达失调,而在性转变时期,Sox9和Amh显著上调将对sd Y和Dmrt1表达产生抑制效应。(2)三倍体虹鳟内源性雌激素缺乏是导致卵巢发育失败的关键因素。(3)三倍体化破坏了虹鳟雌性化通路的调控机制,导致其内源性雌激素合成能力不断下降,进而卵巢发育失败,并最终发生了天然雄性化逆转现象。(4)卵细胞去分化过程对于Cyp19a1a表达及雌二醇合成存在抑制效应。(5)芳香化酶抑制剂能够破坏雌性三倍体虹鳟性腺体细胞及生殖细胞的分化,并显著上调雄性特异基因表达,促进雌性向雄性转变。
【关键词】:虹鳟 全雌三倍体 卵巢败育 性分化机制 发育机制
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:S917.4
【目录】:
  • 摘要9-12
  • 英文摘要12-16
  • 1 前言16-31
  • 1.1 鱼类性别的决定与分化16-22
  • 1.1.1 雌雄异体鱼类性别决定机制18
  • 1.1.2 鱼类性腺分化18-22
  • 1.2 关于性腺分化与芳香化酶的假说22-24
  • 1.2.1 维持卵巢分化的必要条件22-23
  • 1.2.2 生殖细胞增殖和雌激素生成与卵巢分化的潜在关系23-24
  • 1.3 性别分化阶段的基因级联调控24-28
  • 1.3.1 性别分化阶段主要的调控基因24-26
  • 1.3.2 雌性分化阶段潜在的Cyp19a1a上游基因调节反馈循环区26-27
  • 1.3.3 雄性分化阶段雄激素的生理作用及基因级联调控27-28
  • 1.4 三倍体虹鳟的性腺发育与性别反转的研究概括28-29
  • 1.4.1 三倍体虹鳟的性腺发育28-29
  • 1.4.2 全雌性三倍体虹鳟的性反转29
  • 1.5 本研究的意义及主要内容29-31
  • 1.5.1 本研究的意义29-30
  • 1.5.2 主要研究内容30-31
  • 2 材料与方法31-40
  • 2.1 实验材料31-34
  • 2.1.1 实验鱼31
  • 2.1.2 实验鱼养殖条件与养殖管理31-32
  • 2.1.3 实验鱼外源性类固醇激素处理32
  • 2.1.4 外源性激素处理组实验分组32-33
  • 2.1.5 样品采集与制备33-34
  • 2.2 研究方法34-40
  • 2.2.1 三倍体虹鳟的倍性鉴定——DNA含量检测34
  • 2.2.2 三倍体雌性虹鳟细胞遗传学分析——染色体制备34-35
  • 2.2.3 组织学切片制备35
  • 2.2.4 透射电子显微镜检测方法35-36
  • 2.2.5 酶联免疫吸附剂测定(ELISA)——性类固醇激素测定36
  • 2.2.6 Real-time RT-PCR36-38
  • 2.2.7 主要仪器和设备38-40
  • 3 结果与分析40-92
  • 3.1 三倍体雌性虹鳟的倍性验证——DNA含量检测40
  • 3.2 三倍体雌性虹鳟细胞遗传学分析40-41
  • 3.3 二倍体和三倍体虹鳟性腺的分化与发育41-58
  • 3.3.1 二倍体虹鳟性腺分化与发育41-50
  • 3.3.2 三倍体虹鳟性腺分化与发育50-58
  • 3.4 三倍体(XXX)虹鳟性类固醇激素(E2和T)的变化趋势58-61
  • 3.4.1 二倍体虹鳟性类固醇激素的变化58-60
  • 3.4.2 三倍体雌性虹鳟性类固醇激素的变化60-61
  • 3.5 三倍体雌性虹鳟6个候选基因的表达分析61-75
  • 3.5.1 RNA电泳检测结果61
  • 3.5.2 各基因PCR扩增的标准曲线及产物溶解曲线61-64
  • 3.5.3 各目的基因Real Time RT-PCR扩增曲线及产物溶解曲线64-68
  • 3.5.4 sdY测序验证分析68-69
  • 3.5.5 基因表达分析69-75
  • 3.6 雄激素诱导雌性三倍体虹鳟雄性化75-86
  • 3.6.1 雄激素诱导雌性三倍体虹鳟雄性化,性腺发育特征75-83
  • 3.6.2 雄激素诱导雌性三倍体虹鳟雄性化,基因的级联调控83-85
  • 3.6.3 雄激素诱导雌性三倍体虹鳟雄性化,性类固醇激素表达85-86
  • 3.7 雌性三倍体虹鳟性腺去分化期和再分化期雌激素回救处理86-92
  • 3.7.1 去分化期和再分化期雌激素回救处理,组织学86-87
  • 3.7.2 去分化期和再分化期雌激素回救处理,基因级联调控87-90
  • 3.7.3 去分化期和再分化期雌激素回救处理,性类固醇激素表达90-92
  • 4 讨论92-99
  • 4.1 二倍体与三倍体虹鳟性腺分化的区别92
  • 4.2 二倍体与三倍体虹鳟的性腺发育区别92-93
  • 4.3 性别特异基因与性类固醇激素的反馈调控机制93-94
  • 4.4 三倍体雌性虹鳟的6个候选基因的级联调控关系94-95
  • 4.5 雄性化处理对三倍体雌性虹鳟性分化和发育的影响95-96
  • 4.6 雄性化处理对三倍体雌性虹鳟性腺特异基因表达的影响效应96-97
  • 4.7 雌激素处理对去分化期和再分化期三倍体虹鳟雌性化通路的影响97-99
  • 5 结论99-100
  • 致谢100-101
  • 参考文献101-115
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文115-116

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