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《东北农业大学》 2016年
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五元角环多酚类化合物的基因组挖掘

田俊  
【摘要】:五元角环多酚是由24-30个碳的聚酮链前体形成的芳香类化合物,因其中的五元角环核心结构而得名。这一类具有复杂多变结构和多种多样活性的芳香类天然产物,在医药领域有着广泛的应用前景。本研究的目的在于通过基因组挖掘的手段,从放线菌这一重要的天然产物产生者中发现新的五元角环多酚类化合物。论文包含两个部分内容:一是通过对Streptosporangium sp.CGMCC 4.7309的全基因组测序,结合生物信息学分析来发掘其中的五元角环多酚;二是使用基于同源性的PCR筛选策略,从不同来源的放线菌中筛选具有产生五元角环多酚潜力的菌株,进一步获得各种新结构的五元角环多酚。NCBI公开的基因组数据显示链孢囊菌(Streptosporangium)具有很强的生产次级代谢产物的潜力,因此本研究选择Streptosporangium sp.CGMCC 4.7309进行全基因组测序。使用antiSMASH分析了S.sp.CGMCC 4.7309的基因组序列,结果发现其中包含超过20个次级代谢产物基因簇,并从中找到了可能参与合成五元角环多酚的II型聚酮合酶基因簇,该基因簇包含33个开放阅读框。将该基因簇的各个基因所编码的蛋白进行在线BLAST比对,并对它们的功能进行了预测。通过系统进化树分析其中的KSβ与已知五元角环多酚基因簇中的同源蛋白,推测了五元角环多酚的骨架长度含有26个碳原子。多重序列比对分析了可能影响框架结构的Baeyer-Villiger氧化酶Hex18和天冬酰胺合成酶Hex6的活性位点,并且对基因簇产物的结构进行了预测。本论文首次建立了链孢囊菌-大肠杆菌的遗传转化体系,并基因敲除了五元角环多酚合成起始阶段重要的酮基还原酶Hex30,通过比较基因敲除菌株和野生型菌株的代谢谱找到了该基因簇所对应的五元角环多酚类化合物。经过分离纯化得到了3个化合物,分别为hexaricin A、hexaricin B和新化合物hexaricin C。通过LC-MS和NMR分析确定了hexaricins平面结构,并通过理论计算与实验数据(比旋光度和圆二色谱)比较确定了3个化合物的绝对构像。依赖同源性的PCR筛选策略在天然产物产生菌的基因组挖掘上已经取得了巨大的成功。五元角环多酚由II型聚酮合酶合成,之前的筛选体系所采用的探针以聚酮合酶中的酮基合酶基因KSβ为靶点,不能特异性地筛选出具有产生五元角环多酚潜力的菌株。对已报道的五元角环多酚基因簇研究发现,在五元角环多酚基因簇中存在2个特异的单加氧酶编码基因,因此,该基因可以作为靶点设计探针,通过进行PCR筛选策略可特异性筛选出五元角环多酚产生菌。通过对单加氧酶同源蛋白的多重序列比对,实验设计了6对简并引物,并以其中的3对引物对318株放线菌进行PCR筛选,共获得14个阳性菌株,其中的1对引物对筛选出的14个菌株均呈阳性结果,具有较好的筛选效果。选取其中的3株阳性菌株Streptomyces champavatii CGMCC 4.1615、Streptomyces sp.1.093和Streptomyces sp.B81进行基因组测序,分析发现在这3株菌种都含有五元角环多酚基因簇,结果证明了此方法的可靠性。菌株4.1615的五元角环多酚基因簇含有32个开放阅读框,而链霉菌1.093和B81的五元角环多酚基因簇都含有55个开放阅读框。使用在线BLAST推测了各基因的功能,结果显示菌株4.1615中的五元角环多酚基因簇与fredericamycin的基因簇几乎一致;菌株1.093和B81中的五元角环多酚基因簇与xantholipin基因簇具有较高的相似性,进化树分析和多重序列比对显示它们可能生物合成xantholipin结构类似物。在菌株B81中,五元角环多酚基因簇处于沉默状态,通过将基因簇中的正调控基因cds12过表达,激活了该基因簇的表达,并产生了五元角环多酚类化合物。使用ISP3培养基发酵,经过丙酮浸提,乙酸乙酯萃取,硅胶柱层析得到了纯度较高的目标化合物,该化合物的结构鉴定还在进行中。
【关键词】:基因组挖掘 次级代谢产物 五元角环多酚 II型聚酮合酶 基因组测序 PCR筛选
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:Q78
【目录】:
  • 摘要8-10
  • 英文摘要10-12
  • 1 引言12-36
  • 1.1 文献综述12-35
  • 1.1.1 天然产物的与药物开发12
  • 1.1.2 聚酮类化合物的研究概况12-14
  • 1.1.3 II型聚酮化合物研究实例14-17
  • 1.1.4 五元角环多酚的分类17-18
  • 1.1.5 五元角环多酚的研究进展18-27
  • 1.1.6 基因组挖掘发现天然产物27-32
  • 1.1.7 PCR筛选挖掘天然产物32-34
  • 1.1.8 Streptosporangium sp. CGMCC 4.7309的基因组挖掘34
  • 1.1.9 PCR筛选五元角环多酚生物合成基因34-35
  • 1.2 研究的目的与意义35-36
  • 2 材料与方法36-45
  • 2.1 S. sp. CGMCC 4.7309基因组挖掘的材料与方法36-40
  • 2.1.1 实验材料36-38
  • 2.1.2 实验方法38-40
  • 2.2 PCR筛选五元角环多酚合成基因的材料与方法40-45
  • 2.2.1 实验材料40-42
  • 2.2.2 实验方法42-45
  • 3 结果与分析45-76
  • 3.1 S. sp. CGMCC 4.7309的基因组挖掘45-56
  • 3.1.1 建立遗传转化系统45
  • 3.1.2 基因组的测序和II型PKS基因簇的分析45-51
  • 3.1.3 Hexaricins的发现51-52
  • 3.1.4 Hexaricin A、B和C的分离和鉴定52-56
  • 3.2 PCR筛选五元角环多酚合成基因56-76
  • 3.2.1 获得筛选用的简并引物56-59
  • 3.2.2 以简并引物进行PCR筛选59-61
  • 3.2.3 基因组测序和五元角环多酚基因簇的分析61-71
  • 3.2.4 激活五元角环多酚基因簇71-74
  • 3.2.5 B81中五元角环多酚类化合物的分离74-76
  • 4 讨论76-80
  • 4.1 S. sp. CGMCC 4.7309的基因组挖掘76-77
  • 4.1.1 S. sp. CGMCC 4.7309遗传转化系统的建立和基因组挖掘76
  • 4.1.2 Hexaricins的绝对构型76
  • 4.1.3 Hexaricins生物合成途径的推测76-77
  • 4.2 PCR筛选五元角环多酚合成基因77-80
  • 4.2.1 简并引物的PCR筛选方法77-78
  • 4.2.2 测序菌株的选择78
  • 4.2.3 激活B81中沉默的五元角环多酚基因簇78-79
  • 4.2.4 B81中五元角环多酚的分离79-80
  • 5 结论80-81
  • 5.1 本研究主要结论80
  • 5.2 本研究的创新点80-81
  • 致谢81-82
  • 参考文献82-91
  • 附录91-109
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文109

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