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《东北农业大学》 2017年
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猫杯状病毒2280毒株反向遗传系统的建立及初步应用

祖少坡  
【摘要】:猫杯状病毒(Feline Calicivirus,FCV)属于杯状病毒科水疮性病毒属,是感染家猫及野生猫科动物的重要病原之一。FCV感染家猫能够引起呼吸系统疾病、口腔溃疡、结膜炎及慢性肠炎等,强毒感染引起全身系统性疾病(Virulent systemic disease,VSD)并导致较高死亡率。目前,对于该病的预防,仍以疫苗免疫为主,但现有疫苗仅能提供一定的临床保护而不能完全阻止FCV感染,并且康复动物长期持续的排毒,使得该病的防治更加困难。FCV 2280是一株中等毒力的毒株,能引起泛嗜性感染,为了对FCV 2280的致病机制有进一步的了解,我们需要利用反向遗传操作系统来研究病毒基因组结构和功能的关系。我们以p OK-12为载体构建了FCV 2280株的反向遗传系统。首先,依据FCV 2280基因组酶切位点特征,将基因组分为三段依次克隆于p OK-12载体中;同时在基因组5′末端和3′末端分别引入T7 RNA聚合酶启动子和丁型肝炎核酶(Hdv Rz)序列;并将基因组554位的Xba I限制性酶切位点序列进行同义突变作为重组病毒鉴定的遗传标记,获得基因组全长c DNA表达质粒p OK-2280。其次,将该表达质粒线性化和体外转录加帽后,获得基因组RNA;转染CRFK细胞,获得P1代重组病毒;提取病毒基因组RNA制备cDNA模板,对遗传标记进行PCR扩增和Xba I酶切鉴定,结果表明拯救的病毒为重组FCV病毒。最后,生长曲线检测结果显示重组病毒与亲本病毒生长动力学无明显差异。为了鉴定FCV 2280毒株外源基因插入位点,首先,以p OK-2280为基础,分别以p5.6基因的5′末端、p76基因3′末端、VP1基因5′末端及VP1基因第264~265核苷酸之间作为插入位点,构建表达增强型绿色荧光蛋白基因(e GFP)的表达质粒。其次,表达质粒经体外转录和转染CRFK细胞后拯救重组病毒,所获重组病毒分别感染CRFK细胞,进行eGFP表达鉴定,结果表明,只有在VP1基因5′末端以及VP1基因第264~265核苷酸之间两个位点的e GFP可以表达。最后,对e GFP的遗传稳定性进行鉴定,结果表明VP1基因5′末端为插入位点的重组病毒传至第二代时观察不到荧光,而另一组重组病毒传至第5代时观察不到荧光,因此,其稳定性有待进一步提高。通过本研究,我们成功建立了FCV 2280株反向遗传操作系统,并应用该系统对外源基因的插入位点进行初步筛选,这将为猫杯状病毒致病机制的研究奠定基础,也为活载体疫苗研发提供参考。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 周童;仵敏娟;;连接黏附分子A的研究进展[J];生命科学;2013年09期
2 于福先;朱志伟;陈晓宇;潘建治;;真核生物RNA聚合酶Ⅱ核心启动子[J];生命的化学;2011年06期
3 谢守玉;张健騑;吴健敏;白安斌;向华;;猫杯状病毒分子生物学特征及研究进展[J];中国动物传染病学报;2010年06期
4 黄耀伟,李龙,于涟;人类及动物RNA病毒的反向遗传系统[J];生物工程学报;2004年03期
5 高玉伟,夏咸柱,扈荣良,黄耕,徐春忠,王铁东;猎豹与虎猫杯状病毒的分离及其超变区基因比较研究[J];中国预防兽医学报;2003年03期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 郎需龙;IL-10对口蹄疫病毒感染后免疫调控机理影响的研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2009年
2 郑海学;动物RNA病毒反向遗传系统的研究和建立[D];中国农业科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 黄倩倩;猫杯状病毒FB-NJ-13株的分离鉴定及生物学特性研究[D];中国农业科学院;2015年
2 艾纯旭;抗猫杯状病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[D];吉林大学;2013年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 黄翠琴;范克伟;余佳;傅文源;林开雄;杨守深;林青青;杨小燕;;华南虎疑似感染猫细小病毒的PCR鉴定与病理组织学检查[J];中国动物传染病学报;2017年06期
2 张恩柱;赵伟;张淋淋;韩庆玥;张俊华;;大豆花叶病毒侵染性克隆研究进展[J];大豆科学;2017年05期
3 苏悦;罗雪梅;彭杨芷;党思捷;吴文军;苏姣;秦冰;冯全生;;慢性乙型病毒性肝炎脾虚湿热证潜在microRNA表达谱研究[J];中华中医药杂志;2017年05期
4 田耕;腾河;李芳;呼和;张国威;吕广;;头颈部鳞状上皮细胞癌组织中连接黏附分子A的表达及意义[J];中国老年学杂志;2016年22期
5 徐彦召;王青;胡建和;余娟;陈仕均;;利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2016年07期
6 何平;杨文娟;李法凯;赵卫锋;周华波;李瑞凯;梁明丽;韦红云;何剑桥;祝健;韦祖樟;黄伟坚;陈樱;;猫杯状病毒的分离鉴定及其全基因组的序列分析[J];中国动物传染病学报;2016年01期
7 刘春国;刘永相;刘大飞;郭东春;田进;仇铮;刘鑫;蒋艳妹;刘家森;彭永刚;李岩;刘明;曲连东;;猫杯状病毒的分离鉴定及超变区基因序列分析[J];中国预防兽医学报;2015年11期
8 刘永相;李秀云;刘鑫;蒋艳妹;郭冬春;田进;仇铮;邹希明;曲连东;;虎源细小病毒的分离鉴定及其VP2基因分析[J];中国预防兽医学报;2015年09期
9 刘秋艳;应瑛;王一鸣;陈小庆;赵艳丽;胡桂学;;豹源猫杯状病毒ORF2基因的扩增、克隆及原核表达[J];现代畜牧兽医;2015年01期
10 郑翠玲;向华;黄元;陈晶;王晓虎;宣华;;猫杯状病毒感染性克隆的构建[J];中国兽医杂志;2014年11期
中国硕士学位论文全文数据库 前5条
1 祖少坡;猫杯状病毒2280毒株反向遗传系统的建立及初步应用[D];东北农业大学;2017年
2 蒋艳妹;猫杯状病毒VP1抗原性分析及间接ELISA诊断方法的建立[D];黑龙江八一农垦大学;2016年
3 王一鸣;5株猫杯状病毒致病性及免疫原性的比较研究[D];吉林农业大学;2016年
4 李响;吉林省宠物猫传染性鼻结膜炎病原学调查[D];吉林农业大学;2016年
5 黄倩倩;猫杯状病毒FB-NJ-13株的分离鉴定及生物学特性研究[D];中国农业科学院;2015年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 王延树;向华;程淑琴;;猫杯状病毒基因组结构与结构蛋白功能研究进展[J];中国兽药杂志;2007年06期
2 黄耀伟,李龙,李建荣,于涟;传染性法氏囊病病毒感染性克隆的快速构建[J];生物化学与生物物理学报;2003年04期
3 范泉水,夏咸柱,邱薇,黄耕,何洪彬,张建滨,乔军,余春,邹啸环,李金钟,武银莲,殷震;老虎感染猫传染性鼻-结膜炎病毒的研究[J];中国病毒学;2000年04期
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1 李呈军;中国H9N2亚型禽流感病毒进化分析与H5N1亚型禽流感病毒标记疫苗的研究[D];中国农业科学院;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 艾纯旭;抗猫杯状病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[D];吉林大学;2013年
2 姜雪;猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D];吉林农业大学;2013年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 贺争鸣,李冠民;美国兔杯状病毒病的爆发流行[J];实验动物科学与管理;2000年04期
2 陈冬梅,张又,钱渊,Jason Jiang;我国婴幼儿中存在不同基因型杯状病毒的感染[J];病毒学报;2001年03期
3 毛春生,金宁一,殷震;杯状病毒的分类和分子生物学研究进展[J];中国病毒学;1996年02期
4 陈柳;刘光清;宋毅;倪征;余斌;华炯钢;李双茂;云涛;;杯状病毒受体研究进展[J];动物医学进展;2010年07期
5 艾纯旭;樊小烨;孟令伟;高巍;袁宝;陈建;胡进平;任文陟;;抗猫杯状病毒单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定[J];中国农学通报;2012年29期
6 姜雪;高玉伟;胡桂学;杨松涛;赵艳丽;刘秋燕;徐春忠;梁秀娟;夏咸柱;;猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[J];吉林大学学报(理学版);2013年05期
7 赵艳丽;董宏伟;陈小庆;姜雪;刘秋艳;胡桂学;;猫杯状病毒基因及其抗原多样性研究进展[J];中国预防兽医学报;2014年03期
8 庄金秋;梅建国;沈志强;;水貂杯状病毒生物学特性研究进展[J];中国畜牧兽医;2014年03期
9 谢守玉;张健騑;吴健敏;白安斌;向华;;猫杯状病毒分子生物学特征及研究进展[J];中国动物传染病学报;2010年06期
10 王延树;向华;程淑琴;;猫杯状病毒基因组结构与结构蛋白功能研究进展[J];中国兽药杂志;2007年06期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 赵艳丽;姜雪;刘秋艳;陈小庆;胡桂学;;猫杯状病毒基因和抗原多样性研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
2 诸葛小玲;崔大伟;郑书发;陈凌晓;余斐;陈瑜;吴英萍;靳淼;段招军;许世佳;;杭州地区2009-2010年胃肠炎腹泻中杯状病毒流行病学分析[A];2011年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2011年
3 陈小庆;应瑛;范胜涛;赵艳丽;姜雪;刘秋艳;高玉伟;胡桂学;;猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2基因的序列分析[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集[C];2013年
4 何雅青;;杯状病毒的分子流行病学研究[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2010年
5 崔大伟;诸葛小玲;郑书发;余斐;陈瑜;;杭州地区2009-2010年胃肠炎腹泻中杯状病毒流行病学分析[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
6 翁晓刚;朱要宏;王九峰;;反向遗传操作在牛病毒性腹泻病毒研究上的应用[A];中国畜牧兽医学会家畜内科学分会第七届代表大会暨学术研讨会论文集(上册)[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 王雪飞 郑灵巧;缉拿“杯状病毒”添新技术[N];健康报;2006年
2 刘星;感冒也能引起腹泻[N];医药养生保健报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前5条
1 沈权;杯状病毒分子流行病学及病原与宿主互作机制研究[D];上海交通大学;2011年
2 虞凌雪;表达猪GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株的构建及其免疫特性分析[D];中国农业科学院;2014年
3 焦洋;HIV-1耐药相关特征性突变位点及复制适应性研究[D];中国疾病预防控制中心;2015年
4 宋玲玲;牛副流感病毒3型HN基因—牛传染性鼻气管炎重组病毒的构建与鉴定[D];石河子大学;2016年
5 祁小乐;鸡传染性法氏囊病病毒反向遗传操作系统的建立及基因功能研究[D];中国农业科学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 祖少坡;猫杯状病毒2280毒株反向遗传系统的建立及初步应用[D];东北农业大学;2017年
2 黄倩倩;猫杯状病毒FB-NJ-13株的分离鉴定及生物学特性研究[D];中国农业科学院;2015年
3 刘秋艳;基于ORF2基因表达产物的猫杯状病毒间接ELISA方法的建立及其初步应用[D];吉林农业大学;2015年
4 应瑛;猫杯状病毒的分离鉴定及其细胞传代[D];吉林农业大学;2016年
5 王一鸣;5株猫杯状病毒致病性及免疫原性的比较研究[D];吉林农业大学;2016年
6 李永清;我国甘肃省五岁以下腹泻住院儿童杯状病毒分子流行病学研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年
7 姜雪;猫杯状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D];吉林农业大学;2013年
8 艾纯旭;抗猫杯状病毒单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立[D];吉林大学;2013年
9 徐贵财;水貂杯状病毒分离鉴定与生物学特性研究[D];中国农业科学院;2009年
10 严悌昆;猫杯状病毒可插入外源基因位点的研究[D];吉林大学;2007年
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