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《东北农业大学》 2017年
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猫疱疹病毒Ⅰ型US3基因缺失株的构建及生物学特性分析

孙雪  
【摘要】:猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus 1,FHV-1)属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科,是猫病毒性鼻气管炎的病原。猫是其自然宿主,可以引起发热、眼部及鼻部粘膜损伤和明显的上呼吸道感染症状,发病率高达100%,死亡率可达50%。FHV-1 US3基因存在于所有α-疱疹病毒中且高度保守,编码丝/苏蛋白激酶,是重要的毒力基因之一。具有促进病毒包膜与核外膜融合,释放病毒核衣壳到细胞质,完成第一脱膜过程;诱导肌动蛋白应力纤维的解聚和细胞骨架的重排;抗凋亡活性和增强病毒抵抗干扰素的作用。在单纯疱疹病毒和伪狂犬病毒中,US3基因缺失病毒的病毒滴度比亲本病毒的低10到30倍,感染细胞后形成噬斑的数量和大小都随着干扰素浓度增加而显著减少。然而US3基因在FHV-1病毒体内外复制及调节致病性中的作用尚无相关报道,因此本研究构建FHV-1 US3基因缺失株(r FHV-del US3),进行生物学研究,为研究猫疱疹病毒Ⅰ型的致病机制及猫病毒性鼻气管炎的的防控奠定基础。首先制备FHV-1 US3蛋白多克隆抗体。通过PCR方法扩增US3基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a中,构建重组质粒pET32-US3;然后转化至大肠杆菌BL21(DE3),使用1.0mmol/L IPTG诱导表达His-US3重组蛋白。SDS-PAGE和Western blot试验表明,该重组蛋白为可溶性表达,并且具有较好的反应原性。将切胶纯化后的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA检测其效价达1∶10000以上。Western blot和间接免疫荧光(IFA)结果表明,制备的多克隆抗体能够与US3蛋白具有良好的反应原性,为r FHV-del US3的鉴定提供了实验材料。其次以FHV-1 VR-814株为亲本病毒,根据Gen Bank已发表的FHV-1 C-27株基因序列设计引物,分别扩增位于US3基因两侧序列用于同源重组的左侧同源臂(L)和右侧同源臂(R)。将目的片段L和R克隆于已删除CMV启动子的pc DNA3.1(+)载体,并在L与R之间插入CMV-EGFP表达盒,获得转移载体pc DNA3.1-LR-EGFP;提取质粒,转染F81细胞12 h后接种亲本病毒;48 h后收毒,通过噬斑筛选、纯化US3基因缺失病毒。之后,通过PCR和Western blot方法对rFHV-del US3进行鉴定,结果表明FHV-1 US3基因缺失病毒株构建成功。最后为了明确r FHV-del US3的生物学特性,进行了遗传稳定性、对IFN-β启动子激活的影响、体外生长曲线和小鼠致病性试验。结果显示,r FHV-del US3可在CRFK细胞上稳定生长,传至第10代时,病变细胞中仍可见绿色荧光。一步生长曲线及噬斑形成试验结果显示,与亲本病毒相比,r FHV-del US3形成的噬斑大小减小,且复制能力减弱。r FHV-del US3基因编码产物对IFN-β启动子的抑制能力明显减弱。小鼠致病性试验结果表明,亲本病毒组小鼠存活率为75%,而r FHV-del US3组小鼠存活率为100%,且r FHV-delUS3组小鼠肺脏组织中病毒DNA水平明显低于亲本病毒组,表明r FHV-del US3对小鼠的致病能力减弱。本研究利用同源重组技术构建了能够遗传稳定并生长良好的FHV-1 US3基因缺失株,生物学特性分析显示其生长能力、对IFN-β启动子的抑制作用以及对小鼠的致病性均减弱。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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