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《东北农业大学》 2017年
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大肠杆菌不耐热肠毒素2型突变体的构建及其抗原性研究

李婷婷  
【摘要】:犊牛大肠杆菌性腹泻是对新生幼犊造成侵害的一种急性传染病,由致病性大肠杆菌引发,按疾病严重程度分别表现为消化不良、发热、废食、气短、腹泻、自体中毒及心力衰竭。犊牛大肠杆菌性腹泻主要致病因子有肠毒素、黏附素和志贺毒素。不耐热肠毒素II型是导致犊牛腹泻的病原之一。国内外对于LT-II的研究并不广泛,探索LT-II点突变后的毒性改变对深入研究LT-II的致病性分子机制和弱毒疫苗研制均具有重要意义。本研究通过查阅文献,参考LT-II a和LT-II b编码基因关键氨基酸位点的功能,推测rLT-IIc1B亚基氨基酸第13、14位点为与特异性受体结合的关键位点。采用融合PCR的方法将第13、14位苏氨酸突变为异亮氨酸(T13I,T14I),将突变后基因片段最终转入感受态细胞表达毒素突变体r LT-IIc1(T13I-T14I),将r LT-IIc1(T13I-T14I)突变蛋白、未突变重组蛋白rLT-IIc1、野生毒素LT-IIc1分别辅以佐剂,肌肉注射免疫小鼠、家兔,通过间接ELISA技术测定特异性Ig G水平,使用Y-1细胞检测r LT-IIc1(T13I-T14I)、r LT-IIc1、LT-IIc1对细胞最低致死毒性,通过体外中和实验检测中和效价以及交叉中和效价。实验结果显示,rLT-IIc1(T13I-T14I)获得了高效表达。间接ELISA检测结果表明,各免疫组经过相应抗原免疫刺激后所表现的抗体效价有所不同,在35d时抗体水平上升至最高并与对照组相比有显著性差异。其中rLT-IIc1效价可达到1:6400、r LT-IIc1(T13I-T14I)效价为1:5000、天然毒素效价为1:6400。细胞毒性试验显示,r LT-IIc1(T13I-T14I)、rLT-IIc1、LT-IIc1都可以使Y-1小鼠肾上腺皮质细胞发生明显的病变,r LT-IIc1(T13I-T14I)突变蛋白细胞最小致死量为3.52×10-6mg/m L、rLT-IIc1细胞最小致死量为17.8pg、LT-IIc1为4.87×10-11mg/m L。根据中和实验结果通过Reed-Mouch计算r LT-IIc1免疫血清对rLT-IIc1蛋白的中和效价为1:89,对r LT-IIc1(T13I-T14I)蛋白中和效价为1:62;rLT-IIc1(T13I-T14I)免疫血清对r LT-IIc1蛋白的中和效价为1:45,对r LT-IIc1(T13I-T14I)蛋白中和效价为1:35。研究表明,突变体仍然具有免疫活性,突变后对Y-1细胞最小致死量为3.52×10-6mg/m L,毒性降低,体外中和实验显示两种免疫血清对彼此有中和作用。该研究为探索LT-IIc1编码基因关键氨基酸功能提供了新的实验依据。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.612

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