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《东北农业大学》 2017年
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对海南地区Bt菌株cry基因的鉴定、克隆及蛋白活性分析

张月  
【摘要】:目前在农业生产上主要依赖于化学农药,但是化学农药的使用带来了一系列的问题,因此使用一种具有特异、高效的生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)占主要地位,它广泛用于农业、林业及医学害虫的防治,其生产量和使用量占微生物农药的95%以上。苏云金芽胞杆菌可产生晶体蛋白和可溶性分泌蛋白,并且这些蛋白对靶标害虫具有高效特异的杀虫活性,因此在全球范围内得到普遍应用。正是这种杀虫蛋白的效用,也促使我们识别和鉴定出具有不同特异性的新的杀虫蛋白,从而在土壤环境中分离出更多的新型Bt资源,并且具有杀虫特性的Cry蛋白已经广泛被应用于农业害虫的防治,但目前仍然有其他的Bt蛋白还未有明确其靶标害虫。近年来由于在我国农业害虫的逐年加重,农作物的产量逐年下降。因此,现在急需寻找新型的杀虫活性基因这对我国农业害虫的防治具有非常重要意义。本文针对我国棉田鳞翅目害虫进行了菌株的筛选与杀虫基因克隆的研究。本研究的主要内容如下:(1)从中国海南地区采集到2300份土壤,分离出Bt菌株755株,其伴胞晶体类型有长双锥体形、短双锥体形、球形等,本实验根据已知的基因序列设计通用引物,通过聚合酶链式反应(PCR)方法,对2300株Bt菌株基因池DNA混合样品进行PCR鉴定。序列分析结果表明,这些Bt菌株基因池中含有2种cry2类基因,分别为cry2Ab基因和cry2Ag基因,扩增得到cry2Ab和cry2Ag的全长基因序列,分别为1902bp和1891 bp,已提交cry2Ab基因序列(Gen Bank登录号为KX357382)和cry2Ag基因序列(Gen Bank登录号为KX236449)。分别构建p EB-Cry2Ab和pEB-Cry2Ag表达载体,并在大肠杆菌BL21中成功表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,两种Cry2类蛋白均可以表达出分子量为70 kDa的杀虫晶体蛋白。将得到的两种杀虫晶体蛋白分别对鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)进行生物活性的初筛测定,选取初筛活性较高的蛋白再进行复筛,复筛结果显示,成功表达的两种蛋白对小菜蛾和棉铃虫具有较高的杀虫活性。(2)对实验室保存的海南地区菌株Bt BJH500、Bt BJH498进行基因鉴定,通过PCR鉴定发现其中含有cry4基因,再利用全长引物进行扩增,结果获得cry4-like全长基因序列。该序列已提交Gen Bank注册,登录号为KX244950。将得到的全长基因与p EB载体相连,构建表达载体在大肠杆菌BL21中成功表达,通过SDS-PAGE结果显示,可以在大肠杆菌中表达出分子量为43 kDa的晶体蛋白。将表达得到的晶体蛋白对小菜蛾和棉铃虫进行生物活性初步测定,其校正死亡率都较低,结果分析该蛋白对小菜蛾、棉铃虫均无显著杀虫活性。本研究针对我们实验室保存的海南地区菌株,进行菌株筛选、基因型的鉴定与杀虫活性的测定,获得有效菌株Bt BJH500和Bt BJH498。通过聚合酶链式反应(PCR)方法成功克隆杀虫基因3个。研究结果发现两种Cry2类蛋白对三种鳞翅目(Lepidoptera)害虫小菜蛾(Plutella xylostella)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有一定的杀虫活性。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S482.39;Q78

【参考文献】
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