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《东北农业大学》 2017年
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猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

王鑫  
【摘要】:猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)是引起猪繁殖障碍的主要病原之一。PPV的流行范围非常广泛,在世界各地均有感染,给养猪业和畜牧业造成了巨大的经济损失。VP2蛋白是PPV的结构蛋白之一,也是构成该病毒的主要衣壳蛋白,其携带了主要的抗原决定簇,决定着病毒的组织嗜性、抗原性、致病性等多种主要的生物学特性。本研究将实验室保存的重组杆状病毒Ac NPV-VP2同步接种于昆虫细胞Sf9,36 h后收集病毒,并进行SDS-PAGE电泳,随后利用Western blot对其结果进行分析,结果显示蛋白成功的获得了高效表达。通过Ni柱树脂纯化,以及切胶纯化等方法,将表达的VP2蛋白进行纯化,并利用抗His标签蛋白单抗作为一抗,对纯化后的蛋白进行Western blot分析,结果表明,纯化效果良好,蛋白可用于后续的研究。将纯化后得到的VP2蛋白作为免疫原,采用皮下注射的方式免疫6周龄的BALB/c小鼠,经过三次基础免疫和一次加强免疫后,利用细胞融合技术,将脾细胞与杂交瘤细胞进行融合。之后用间接ELISA方法进行筛选,经过3次以上细胞亚克隆,最终成功获得了1B3、2E5、5F8三株能够稳定分泌的抗VP2蛋白抗体的杂交瘤细胞。经鉴定,3株杂交瘤细胞的亚型均为IgG1型;杂交瘤细胞培养上清效价为1:800-1 000,将杂交瘤细胞按适当的量腹腔注射已经注射石蜡一周的BALB/c小鼠,检测获得的腹水效价为1:32 000-64 000。为进一步鉴定3株单克隆抗体的免疫反应性,收集同步接种猪细小病毒后的ST细胞,并以此为检测用免疫原,检测单克隆抗体的免疫原性。对其及进行了Western blot检测,结果表明3株单抗均可以对PPV全病毒以及重组VP2蛋白特异性识别;间接免疫荧光结果表明,3株单抗均产生荧光,可以与PPV全病毒发生反应;特异性试验表明,3株单抗均不与TEGV和PEDV等病毒发生反应,仅特异性与PPV发生反应;将在体外连续传代3个月和冻存后再复苏的3株杂交瘤细胞做了稳定性分析,结果表明,3株单抗的稳定性较好。本研究成功筛选了3株具有较高的反应原性和特异性的猪细小病毒结构蛋白VP2的单克隆抗体,为后期建立有效的PPV特异性血清学检测方法奠定了理论依据,同时也为PPV受体及感染机制的研究提供了物质基础。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

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