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《东北农业大学》 2017年
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表达猪圆环病毒2型Cap蛋白重组乳酸乳球菌的构建及其免疫效果评价

孙博  
【摘要】:猪圆环病毒(Porcine circoviru,PCV)是圆环病毒科,圆环病毒属的成员,分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1不致病,但PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、先天性震颤和猪皮炎肾炎综合征等多种疾病,急性暴发时猪群的死亡率可达50%,对养猪产业危害严重。在PCV1与PCV2的基因组中约含有11个开放阅读框(ORF),PCV的复制蛋白Rep由ORF1编码,病毒衣壳蛋白Cap主要由ORF2基因编码。ORF2编码的结构蛋白Cap是病毒主要的保护性抗原,与病毒免疫机制关系紧密,是临床研制PCV亚单位疫苗的首选蛋白。乳酸乳球菌由于自体分泌的外源蛋白少,作为亚单位疫苗的宿主载体,重组菌具有可以直接饲喂不需纯化的优点。本实验将以乳酸乳球菌作为宿主菌,利用p H诱导型表达载体p AMJ399构建表达Cap蛋白的重组乳酸乳球菌。该菌株在发挥乳酸菌益生作用的同时亦可表达Cap蛋白,作为防制猪圆环病毒病的重组亚单位活载体疫苗,为PCV新型口服疫苗的研究提供新思路。本实验通过PCR扩增获得了含有两个酶切位点Bgl II和Pst I并去除核定位信号序列的PCV2 Cap基因片段约579 bp,将Cap基因与乳酸乳球菌表达质粒p AMJ399连接,转化入大肠杆菌感受态TG1中,获得重组质粒p AMJ399-Cap,再将重组质粒电转入乳酸乳球菌感受态细胞MG1363中,获得重组乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363。SDS-PAGE检测可见诱导后的重组菌p AMJ399-Cap/MG1363在约28 k Da处出现与预期结果大小相符合的目的带,以PCV2单克隆抗体3C11上清进行Western blot检测,可见重组菌p AMJ399-Cap/MG1363在约28 k Da处出现了特异性的反应带,表明Cap蛋白在重组乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363中获得了表达。间接免疫荧光实验和ELISA检测结果表明表达的Cap蛋白即可分泌于培养液中,同时也分布于菌体表面。对构建的重组乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363进行生物安全性评价。通过重组菌在模拟消化道环境中的生存性能以及口服后在消化道内的存留情况分析,结果显示重组菌在p H3.5的胃液环境下作用5 h存活率为63.09%,在肠液环境下重组菌可存活24 h以上,对5%的盐浓度具有较好的耐受能力。单次灌胃重组菌后4 h,小鼠空肠和结肠均检测到较强的重组菌存留信号,荧光强度显著高于对照组;8 h时,各肠段荧光信号均较弱,表明重组菌存留较少;连续灌胃4天,在第5 d检测时,重组菌在空肠、回肠和结肠各肠段均有明显的荧光信号,表明均有重组菌的存留,而在检测的第6 d和11 d,除空肠和回肠没有荧光信号外,结肠均有明显的荧光信号,可见重组菌可在肠道内存留10天以上。为进一步探讨重组乳酸乳球菌的免疫效果,本实验以小鼠作为实验动物,进行口服免疫。实验共分为3组:实验组口服免疫重组菌p AMJ399-Cap/MG1363,剂量4×107CFU/只;对照组分为空载体组与PBS组,分别口服免疫空载体菌p AMJ399/MG1363,剂量4×107 CFU/只和相同体积的PBS。免疫程序为:免疫两次,每次免疫间隔2周,每次连续免疫3天,每天免疫一次。在免疫前和免疫后不同时间收集粪便、血清和肠黏液样品,分别通过ELISA方法检测粪便中特异性s Ig A水平、血清中特异性Ig G水平和肠黏液中特异性s Ig A水平。结果显示,重组菌口服免疫小鼠,可以提高小鼠的日采食量,增加日增重量;免疫重组菌p AMJ399-Cap/MG1363的小鼠s Ig A和Ig G水平均高于对照组,表明口服乳酸乳球菌既可诱导机体产生局部的黏膜免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。IL-4和IFN-γ两种细胞因子的检测结果表明,重组菌组和空载体组在免疫后有明显升高趋势,与PBS组相比,差异显著。表明在免疫重组菌后既可以诱导机体产生细胞免疫应答也可以产生体液免疫应答。本实验构建的重组乳酸乳球菌p AMJ399-Cap/MG1363可稳定表达PCV2 Cap蛋白并具有良好的安全性,口服免疫可以诱导机体产生特异性免疫应答。本研究为重组乳酸乳球菌口服疫苗防制猪圆环病毒病奠定了基础。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.651

【参考文献】
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