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《东北农业大学》 2019年
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香芹酚和百里香酚对两株食源性腐败菌生物膜的抑制作用研究

靳盼盼  
【摘要】:Enterobacter cloacae(阴沟肠杆菌)和Enterococcus faecalis(粪肠球菌)广泛存在于环境及动物肠道中,容易成为原料肉中的优势腐败菌。在食品加工过程中的腐败菌定植在设备和食品表面形成生物膜后,不容易被彻底灭活而造成产品腐败或者食源性疾病爆发。香芹酚和百里香酚是从天然植物精油中分离出的具有广谱抑菌效果的抗菌剂,且被欧盟委员会和美国食品药品管理局认定可以作为食品添加剂使用。当今对香芹酚和百里香酚影响这两株腐败菌生物膜形成的研究鲜有报道。本文以从低温肉制品中分离的E.cloacae C4和E.faecalis R612为对象,研究香芹酚和百里香酚对这两株菌生物膜形成能力的影响,并对香芹酚和百里香酚抑制这两株菌生物膜形成的调控机制进行探究。为香芹酚和百里香酚控制食源腐败菌生物膜形成的应用提供理论依据,为未来食源腐败菌生物膜形成靶向调控抑制提供数据支持,为以后开发抑制或清除生物膜等方面的消毒剂提供研究基础。论文具体研究内容和结果如下:(1)香芹酚和百里香酚对E.cloacae C4的最小抑菌浓度(Minimal Inhibit Concentration,MIC)为256μg/mL,1/2 MIC处理会抑制E.cloacae C4浮游细菌的增殖能力,1/4 MIC和1/8 MIC处理不会影响浮游细菌的生长;通过结晶紫染色初步判定E.cloacae C4有较强的生物膜形成能力以及香芹酚和百里香酚均可抑制E.cloacae C4生物膜的形成;平板计数法测定不同浓度的香芹酚和百里香酚对E.cloacae C4生物膜内菌落总数的影响:1/2 MIC香芹酚和百里香酚的处理显著降低培养时间24 h以内的E.cloacae C4生物膜内菌落总数;苯酚-硫酸法测定生物膜内胞外多糖含量变化发现:1/2 MIC和1/4 MIC香芹酚和百里香酚可以显著降低胞外多糖的含量;扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)和激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)发现,香芹酚和百里香酚使细菌菌体变长、生物膜聚集过程变慢、厚度降低。高浓度(2048μg/mL)的香芹酚和百里香酚处理E.cloacae C4形成3天的生物膜30 min,生物膜内菌数下降为原来的一半。实时荧光定量PCR结果表明:1/4 MIC香芹酚和百里香酚处理E.cloacae C4后,与生物膜形成相关的菌毛合成基因(csgG、csgB、csgE、csgF)、细胞分裂基因(mraZ、ftsA、ftsL、ftsQ、ftsZ)、胞外多糖合成基因(wcaA、wcaM、wza、wzb、rcsA)显著下调。(2)香芹酚和百里香酚对E.faecalis R612的MIC为512μg/mL,1/2 MIC香芹酚会抑制E.faecalis R612浮游细菌的增殖,百里香酚和香芹酚的作用效果基本一致,但是1/4 MIC百里香酚在前6 h会抑制E.faecalis R612浮游细菌的增殖;通过结晶紫染色初步判定E.faecalis R612有较强的生物膜形成能力,但弱于E.cloacae C4;平板计数法测定香芹酚和百里香酚对E.faecalis R612生物膜内菌落总数变化:在72 h培养时间内,与对照组相比,1/2 MIC处理显著降低E.faecalis R612生物膜内菌落总数,1/4 MIC、1/8 MIC处理组对E.faecalis R612生物膜内菌落总数无显著抑制作用;苯酚-硫酸法测定生物膜内胞外多糖含量变化发现:1/2 MIC和1/4 MIC香芹酚和百里香酚可以显著降低胞外多糖的含量,1/8 MIC处理组在培养时间内对抑制胞外多糖分泌无显著影响;SEM和CLSM结果表明,香芹酚和百里香酚对生物膜内细菌形态无影响,但生物膜聚集过程变慢、厚度降低、结构松散。高浓度(2048μg/mL)的香芹酚和百里香酚处理E.faecalis R612形成3天的生物膜15 min,生物膜内菌数下降为原来的一半。实时荧光定量PCR结果表明:E.faecalis R612中关于生物膜形成的菌毛合成基因(ebpR、ebpA、ebpC)、细胞分裂基因(ftsQ、ftsA)、胞外多糖合成基因(epaA、epaB、epaE、epaG、epaH、epaM、epaQ、epaR)、群体感应基因(luxS)显著下调。(3)运用高通量测序技术对E.cloacae C4全基因组测序并结合生物信息学分析,E.cloacae C4全基因组序列总长度为4,879,501 bp,序列比对后得到编码基因4531个,编码基因占全基因组的88.7%,基因平均长度为956 bp。同时预测到其他基因元件(3个前噬菌体和10个基因岛),对编码基因功能注释发现E.cloacae C4存在关于肠杆菌胞外多糖克拉酸合成调控系统的全部基因。(4)根据香芹酚和百里香酚对E.cloacae C4处理后生物膜内相关基因的相对表达量,推测香芹酚和百里香酚可能通过影响HNS→rcsA→wca基因簇的级联调控途径影响胞外多糖克拉酸的合成,进而抑制E.cloacae C4生物膜内胞外多糖的合成。以pDE 1为表达载体,构建重组质粒hns-pDE 1和体外重组蛋白表达菌株hns-pDE 1-BL21,成功诱导重组蛋白HNS过量表达,经纯化、除盐、浓缩后得到高纯度HNS蛋白。通过生物分子相互作用仪,发现HNS蛋白可以特异性紧密结合RcsA启动子,动力学平衡解离常数为8.082E-9。说明全局调控因子HNS蛋白参与E.cloacae C4胞外多糖合成级联调控途径,在转录水平上调控RcsA的合成。由此研究结果表明,香芹酚和百里香酚可以抑制E.cloacae C4和E.faecalis R612生物膜的形成,主要是影响了生物膜形成的初始粘附和胞外多糖的分泌。香芹酚和百里香酚同分异构体的差异(酚羟基位置不同)不会对同一菌株的抑制效果产生规律性差异。根据E.cloacae C4生物膜内胞外多糖及其上游调控基因相对表达量的变化推测香芹酚及百里香酚通过HNS→rcsA→wca基因簇的级联调控途径影响E.cloacae C4胞外多糖克拉酸的合成,初步确定全局调控因子HNS在转录水平上影响RcsA的合成。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:TS201.3

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