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《东北农业大学》 2000年 博士论文
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大豆抗虫基因转移及其转化系统优化研究

周思军  
【摘要】: 采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将Bt基因(cryLA)导入大豆。从发芽 5-7天的大豆无菌苗切取子叶节外植体,经农杆菌感染和共培养后,在选择培养基上4周 左右出现抗性不定芽。将不定芽转移到芽伸长培养基上,4-6周后再生苗长至2.5-3cm高。 再将再生苗切下转入生根培养基,2周左右生根。生根后的再生植株经逐步锻炼移入盆中, 所有植株均能正常开花结荚。在移栽成活的8株T_0植株中有7株PCR检测呈阳性反应; 在7个T_1株系中有4个株系存在PCR阳性植株。取4个稳定遗传的T_1代株系内的阳性植 株的叶片提取DNA,用地高辛标记的Bt基因探针进行Southern杂交分析,结果4个株 系均呈现阳性,证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内并能传递给后代。转基因植株 的叶片能在含卡那霉素的培养基上形成愈伤组织;转基因植株的叶片和茎切片能被X-Gluc 不同程度地染色;苜蓿夜蛾幼龄幼虫的接种鉴定,有两个转基因株系表现出明显的抗虫 性。这些结果证明被转的nptⅡ、gus和Bt基因均在转基因植株中得到表达。 以发芽5天的大豆无菌苗的下胚轴切段为外植体,以抗性愈伤为指标,对影响农杆 菌介导的大豆转化的因子进行了研究,结果表明: 1.大豆品种对农杆菌的敏感性普遍偏低,平均反应频率只有4.0%,并且在基因型 之间存在显著差异。 2.不同大豆品种对选择剂的敏感性存在一定差异。4种选择剂比较,PPT抑制效果 最好,品种之间比较稳定;潮霉素次之;卡那霉素的有效浓度最高。4种选择剂的适宜浓 度分别为:卡那霉素100-200mgl~(-1);G418 50-75mgl~(-1);潮霉素20-30mgl~(-1);PPT5mgl~(-1)。 3.农杆菌感染时间和共培养时间均对大豆的转化有明显的影响。感染时间以8分钟 左右为宜;共培养时间以2-4天为宜。感染时间和共培养时间之间似乎存在一定的交互 作用。在本试验条件下,两者的最佳组合为感染8分钟共培养3天。 4.在农杆菌感染和共培养阶段的乙酰丁香酮浓度和pH值均对大豆转化频率有明显 影响。pH值以5.4-5.6为宜,超过5.8时转化频率明显下降。50-200uM乙酰丁香酮均显 著提高大豆的转化频率,但浓度不宜过高,过高浓度(400μM)反而降低转化频率。最 佳浓度为100μM。 5.在感染农杆菌之前,让外植体在高渗培养基上预培养一段时间能提高大豆下胚轴 切段的转化频率。最适预培养天数为1天。 用花粉管通道法转化大豆,共操作5000多朵花,获得4500多粒种子。用Bt基因的 特异引物筛选到4株PCR阳性的T_1植株。对4株PCR阳性的T_1代植株进行了PCR-Southern 分析,结果4株PCR阳性植株和质粒的扩增产物均有杂交信号而阴性对照没有,表明PCR 扩增结果可靠。T_2代有两个株系内有PCR阳性植株。两个T_2代阳性株系中的阳性植株有 微弱的GUS表达,对苜蓿夜蛾抗性不明显。其中一个株系呈现大致3/1的分离比例。另 博士学位论文 大豆抗虫基因转移及其转化系统优化研究 东北农业大学 一株系则出现l/4的白化致死苗,存活的植株中IyR阳性植株与阴性植株的比例为y]。 与农杆菌介导法相比,花粉管通道法的转化过程中缺少选择环节,少数的转化体淹 没在大的4瞄化群体之中。因此,后代的筛选至关重要。用PCR法筛选花粉管通道法 转化的后代,具有简便、快速、经济等优点。用自动螺钉旋具改制成微量样品研磨器, 在1.snd的微量离心管内研样,解决了大豆鲜组织的大批量小样品的无损耗快速研磨问 题;简化了模板DNA的提取程序;筛选时将SWe为一个样品,发现阳性反应后,再分 别检测同一管内的5个植株,大大提高了筛选效率。 为了明确大豆花粉WfP源DNA导入的适宜时期,对大豆受粉和开花时 间、花粉管的发育和通道的形成及开花前花蕾外部形态的变化进行了观察。得出如下结 论; 1.大豆自花受粉的时间主要受气温的影响,在一定的天气条件下时间比较稳定,自 花受粉距离开花的时间更稳定,一般为4个小时。因此,可根据大豆的开花时间或气温 推断大豆的自衣迟a盼时间。 2.在同一时间内自花受粉后、开花前的花蕾形态无明显差异;在大豆开花的后期, 花蕾发育的同步性降低,花蕾外部形态与内部发育的关联度也陶氏。因此,在用开花前 的花蕾进行DNA导入时,如以花蕾的外部形态为指标选取花蕾应考虑时间因子。 3.花粉管的下部自接近子房的位置开始形成大量的删用塞以堵塞花粉管,所以外源 DNA不太可能通过花粉管内部进人子房,而可能是通过花粉管通道即大量花粉管穿过花 柱进入子房所形成的通道进入子房的。 4.虽然大豆在开花前己经自花受粉,但开花前很少有花粉管进人花柱,开花后46 小时才能在花柱内观察到较多的花粉管。因此,$佣花粉管通道导【源DNA的适宜 时期可能在开花后。


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