收藏本站
《东北农业大学》 2000年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究

郭巍  
【摘要】: 本研究在PCR-RFLP方法的基础上,采取部分酶切质粒DNA建立质粒文库以及通 过Southern杂交的克隆策略,分别克隆了cry2Aa8、cry2Aa9基因,构建了含有cry2Aa8 基因的Bt工程菌BiotⅡ20、BiotⅡ176和BiotⅡ732,进行了BiotⅡ176杀虫活性的测定。 1 B-G-8及Bt66菌株中cry2Aa基因的克隆 对东北农业大学提供的B-G-8菌株质粒DNA用Sau3AI部分酶切,回收4-7kb酶 切片段,与BamHI酶切的克隆载体pUCP19连接,构建了重组质粒文库。通过PCR鉴 定、筛选,克隆了4.5kb含cry2Aa全长基因的片段,并完成了亚克隆和全序列测定。 编码区全长1902bps,编码633个氨基酸的晶体蛋白,分子量为70.853kDa,等电点 pHi8.185,属弱碱性蛋白。该基因已在EMBL、GenBank中登记,Accession Number为 AJ273218,并提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会,被正式命名为cry2Aa9。 鉴定发现,Bt66菌株含有cry1Ea及cry2Aa两种基因。以PCR扩增产物为探针, 对Bt66菌株质粒完全酶切产物进行Southern杂交,结果表明该基因定位于质粒DNA HindⅢ酶切的5.0kb片段上。将此片段克隆到pBluescriptSK(+)HindⅢ位点,并转化大 肠杆菌JM107。PCR及限制性酶切分析结果表明,5.0kb阳性片段含有cry2Aa基因。 以此结果克隆了cry2Aa基因,并获得了4.0kb的亚克隆。核酸序列分析及氨基酸同源 性比较,在该基因编码区第795位碱基与已知的cry2Aa1、2、3基因存在差异,由A 变为G,其编码的氨基酸也由丝氨酸(Ser)变为甘氨酸(Gly),表明Bt66菌株中的cry2Aa 基因是一种新基因。该基因编码区为1902bps,编码633个氨基酸的晶体蛋白,分子量 为70.821kDa,等电点为pHi8.185,属弱碱性蛋白。该基因已在EMBL、GenBank中登 记,Accession Number为AJ252262,并提交国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会,被正 式命名为cry2Aa8。 2 cry2Aa基因的表达及工程菌的构建 将cry2Aa8、cry2Aa9全长基因分别克隆于pGM1105和pHT315多克隆位点上, 分别获得表达载体pGW1105(Bt-E.coli-Pf穿梭)和pZG315(Bt-E.coli穿梭)。电 击转化Bt无晶体突变株BE20、Bt自然菌株UV17、HD-73,构建了BiotⅡ20、BiotⅡ176 和BiotⅡ732三种Bt工程菌。PCR可检测到cry2Aa基因的存在。经光镜观察,发现工 程菌BiotⅡ176及BiotⅡ732中既有Cry2Aa8的方形晶体,又有Cry1Ba和Cry1Ac的菱 形晶体存在。SDS-PAGE电泳表明,BiotⅡ176和BiotⅡ732中均能表达70kDa蛋白。证 明cry2Aa8基因在UV17和HD-73中能正常表达。cry2Aa8基因在无晶体突变株BE20 中表达不稳定。将pGW1105转化荧光假单胞菌P303,经PCR及DNA酶切检测证明 转化成功。生长曲线测定表明,外源基因cry2Aa的导入对受体菌UV17和HD-73的生 长速率无影响。 3 工程菌室内杀虫活性测定 测定双价基因工程菌BiotⅡ176(cry2Aa+cry1Ba)对小菜蛾幼虫活性,以单一基因 自然菌株UV17(cry1Ba)作阳性对照,结果表明,BiotⅡ176杀虫效果高于UV17,二 者表现协同增效作用。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2000
【分类号】:S476.1

手机知网App
【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王永;高毒力苏云金杆菌菌株的筛选及cry2Ab基因的克隆[D];河北农业大学;2003年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张光焰,张杰,彭于发,赵建周,陈彩层,徐樱,黄大;用电激转化法构建杀虫防病荧光假单胞菌[J];中国农业科学;1995年04期
2 宋福平,张杰,谢天健,杨自文,戴莲韵,李国勋;苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立[J];中国农业科学;1998年03期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王芳,张斌,单雷,毕玉平,许泽永;一种从花生种子中提取RNA的改进方法[J];花生学报;2002年04期
2 李庆云,庄东红,胡忠,黄秀丽;花生不同部位对提取DNA的影响[J];花生学报;2003年02期
3 冯蕾,杨新平,古丽努尔,陈竞;XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1的克隆、表达及序列分析[J];皮革科学与工程;2005年04期
4 潘洁茹;关怡;郑能雄;黄天培;关雄;;含铀土壤中苏云金芽胞杆菌的分离与鉴定[J];莆田学院学报;2010年02期
5 李凤梅;刘均洪;任大明;;HCV e2-3pcx融合基因原核表达载体的构建及蛋白的初步表达[J];青岛科技大学学报(自然科学版);2007年05期
6 王高歌,杨官品,茅云翔,张宝红,张学成;螺旋藻胞外和胞内核酸酶活性研究[J];青岛海洋大学学报(自然科学版);2001年06期
7 李筠;周宏霞;刘佳琳;张跃峰;陈吉祥;张晓华;;青岛近岸特征环境中海洋异养细菌的分布规律及其分子鉴定[J];中国海洋大学学报(自然科学版);2006年06期
8 姜淑芳,王珊,盛云杰,王宜军,张桂珍;弓形虫p~(22)抗原基因克隆的构建[J];实用医药杂志;2002年01期
9 刘晓峰,权启镇,王丽娟,齐风,孙自勤,王要军;灌洗法检测减毒鼠伤寒杆菌疫苗对幽门螺杆菌的免疫应答[J];实用医药杂志;2003年11期
10 沈利群;梁华平;徐祥;吕凤林;李生茂;;核因子-κB p50亚基同源结构域相互作用多肽的筛选[J];实用医药杂志;2006年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 左广胜;郭玉杰;;苏云金杆菌β-外毒素的活性作用及评价[A];杀虫微生物[C];1992年
2 闫冰;罗绍彬;闫建平;王惠杰;;苏云金杆菌Tm13-14菌株晶体毒素及毒力特性[A];杀虫微生物[C];1992年
3 管玉霞;陈世夫;李德臣;武秀兰;陈英杰;;B.S2362与BtH_(14)混用灭蚊幼虫的室内和野外试验[A];杀虫微生物[C];1992年
4 王安福;陈少莲;韩佩娥;章剑林;桑金隆;;对苏云金杆菌库斯塔克亚种Bt_4菌株的研究[A];杀虫微生物[C];1992年
5 徐加生;郭朗蕉;;苏云金杆菌悬浮乳剂防治玉米螟施药技术探讨[A];杀虫微生物[C];1992年
6 王春花;成军;郎振为;吴煜;杨艳杰;张黎颖;刘妍;;基因表达谱芯片技术筛选XTP3蛋白反式调节基因[A];第一届全国人工肝及血液净化学术年会暨全国人工肝及血液净化攻关协作组成立大会论文集[C];2004年
7 唐南洪;王晓茜;李秀金;陈燕凌;;构建特异高表达人谷氨酰胺合成酶基因(hGS)的肝细胞[A];第三届全国重型肝病及人工肝血液净化学术年会论文集(上册)[C];2007年
8 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年
9 张青文;段灿星;徐静;张正伟;杨青芹;;小麦杀虫荧光假单胞工程菌的杀虫效果[A];新世纪(首届)全国绿色环保农药技术论坛暨产品展示会论文集[C];2002年
10 冯书亮;曹伟平;陈国华;王容燕;王金耀;杜立新;;氮素营养对金龟子有效的苏云金杆菌HBF-1芽孢萌发的影响[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郎晓磊;肠道菌对苏云金芽胞杆菌家蚕杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
2 薛妍;肠道菌对苏云金芽胞杆菌棉铃虫杀虫活性的作用[D];华中农业大学;2010年
3 逯晋忠;苏云金芽胞杆菌对云斑天牛的抗性研究[D];华中农业大学;2010年
4 刘姣;苏云金芽胞杆菌Sigma35因子对杀虫晶体蛋白基因表达的影响[D];华中农业大学;2010年
5 李红;苏云金芽胞杆菌YBT1520杀虫晶体突变株的蛋白质组学分析[D];华中农业大学;2010年
6 付雪林;转Bt基因甘蓝的抗虫性研究[D];华中农业大学;2010年
7 刘艳菊;发根农杆菌介导的Bt基因Cry8e转化大豆抗蛴螬研究[D];河南师范大学;2010年
8 赵丹;苏云金杆菌Enhancin-like蛋白的鉴定及增效作用分析[D];河北农业大学;2011年
9 冯静静;苏云金杆菌cry7Ab8基因的克隆表达及工程菌构建[D];河北农业大学;2011年
10 郭培鑫;转基因杨树抗虫性及对节肢动物群落影响的初步研究[D];河北农业大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 蔡启良,刘子铎,孙明,魏芳,喻子牛;苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析[J];生物工程学报;2002年05期
2 陈建武,余健秀,胡晓晖,庞义;苏云金杆菌营养期杀虫蛋白的研究[J];中国生物工程杂志;2002年03期
3 张用梅,杨一平,陈宗胜;聚丙烯酰胺凝胶电泳对几个苏芸金杆菌变种营养细胞酯酶图型的分析[J];微生物学通报;1979年01期
4 张剑冰;欧广东;王波;喻子牛;;苏芸金杆菌高毒力菌株筛选方法研究[J];微生物学杂志;1992年02期
5 王瑛;白成;温洁;;苏芸金杆菌晶体与芽孢分离的研究[J];微生物学报;1980年03期
6 张用梅;陈宗胜;;苏芸金杆菌的酯酶分析[J];微生物学报;1981年02期
7 郭三堆;洪朝阳;王京红;王明波;俞梅敏;范云六;;苏云金芽孢杆菌鲇泽变种7-29杀虫蛋白质结构基因的改造和表达[J];微生物学报;1992年03期
8 戴顺英,高梅影,李小刚,李荣森;我国南北方土壤中苏云金芽孢杆菌的分布及杀虫特性[J];微生物学报;1996年04期
9 宋福平,张杰,谢天健,杨自文,戴莲韵,李国勋;苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立[J];中国农业科学;1998年03期
10 范秀华;冯书亮;邢建民;付韵芹;王容燕;;河北苏云金杆菌的分布与不同土壤类型及不同植被种类的关系[J];中国生物防治;1996年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 李海涛,王洪成,刘志洋;Bt杀虫晶体蛋白的研究概述[J];黑龙江农业科学;2004年05期
2 戴莲韵;苏云金芽孢杆菌菌种保藏[J];林业科学;1996年06期
3 宋福平,张杰,顾爱星,陈中义,姚江,李国勋,黄大昉;苏云金芽孢杆菌cry1I基因沉默的研究[J];自然科学进展;2002年09期
4 李江,闫建平,蔡全信,袁志明;苏云金芽孢杆菌vip3A基因的检测[J];华中农业大学学报;2005年02期
5 丁学知,邹先琼,孙运军,付祖姣,高必达,夏立秋;苏云金芽孢杆菌4.0718菌株晶体毒素性质的研究[J];农业生物技术学报;2005年03期
6 聂智毅,黄俊生;苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因工程研究进展[J];华南热带农业大学学报;2005年02期
7 宋玲莉,高梅影,戴顺英,彭可凡;苏云金芽孢杆菌抗东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)的活性[J];应用与环境生物学报;2005年05期
8 ;生物防治[J];生物技术通报;1994年05期
9 张灵玲,林晶,骆兰,方昉,黄天培,徐金汉,吴光远,王庆森,关雄;叶面分离Bt及对茶树主要害虫高毒力菌株的筛选[J];茶叶科学;2005年01期
10 翟兴礼;Bt-8010和Bt-7216对紫外线的抗性研究[J];河南农业科学;2005年09期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘晓垒;何晓明;陆琼;束长龙;张永军;张杰;宋福平;;几株苏云金芽孢杆菌对小地老虎的毒力评价[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
2 李荣森;戴顺英;李小刚;;我国土壤中的苏云金芽孢杆菌资源及其主要生物学特性[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
3 姚昕;刘春勇;陈月华;任改新;;苏云金芽孢杆菌的电穿孔及其工程菌的构建[A];全国生物防治暨第八届杀虫微生物学术研讨会论文摘要集[C];2000年
4 李今煜;陈聪;;苏云金芽孢杆菌发酵技术的研究现状[A];第四届全国绿色环保农药新技术、新产品交流会暨第三届生物农药研讨会论文集[C];2006年
5 李凤梅;李平;闫敏;郑爱萍;孙惠青;;苏云金芽孢杆菌的筛选和初步鉴定[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
6 吴燕榕;乐黄莺;冯智龙;刘舟;关雄;;苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)营养期杀虫蛋白(VIPs)的初步研究[A];中国蛋白质组学首届学术大会论文摘要集[C];2003年
7 孙晓东;朱辉;唐庆华;覃伟权;;琼海市槟榔园苏云金芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
8 苏俊平;葛东华;郭丽伟;宋萍;王勤英;;对鳞翅目害虫广谱高效的苏云金芽孢杆菌的筛选及鉴定[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
9 郭丽伟;宋萍;王华堂;苏俊平;王勤英;;抗东亚飞蝗的苏云金芽孢杆菌的筛选及分析[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
10 張用梅;劉娥英;袁平;張令要;蔡全信;袁志明;;对夜蛾科害虫及蚊幼虫高毒力苏云金芽孢杆菌的分离及其特性[A];’98海峡两岸害虫生物防治学术研讨会论文摘要[C];1998年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 湖南省植物保护研究所研究员张松柏 刘勇;何谓生物农药[N];湖南科技报;2010年
2 ;生命因科学而富有[N];兵团日报(汉);2006年
3 周韧 通讯员 李倩婷;七大农业项目对接高校[N];长江日报;2007年
4 记者 张颖 伊洁;农林大学学生喜获“挑战杯”特等奖[N];福建日报;2005年
5 科技部;新疆第一个转基因抗虫棉新品选育成功[N];农资导报;2006年
6 本报记者  范建;夺回失去的棉花市场[N];科技日报;2006年
7 记者 赵引德;新型高效广谱菌株安全环保经济[N];农资导报;2007年
8 记者 瞿剑;破解Bt棉种植和转基因生物安全世界性难题[N];科技日报;2008年
9 本报记者 罗晖 实习生 李智勇;Bt转基因水稻真的有毒吗?[N];科技日报;2005年
10 辛华;俄罗斯研制出新型生物杀虫剂[N];农资导报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 姚江;高效广谱苏云金芽孢杆菌Ly30株的分子生物学研究[D];中国农业科学院;2002年
2 李江凌;成华猪γ-干扰素基因克隆及表达效应研究[D];四川大学;2002年
3 宋福平;苏云金芽孢杆菌cry1le1和cry8基因的研究[D];中国农业科学院;2003年
4 武梅;成华猪白细胞介素—4基因克隆及表达效应研究[D];四川大学;2002年
5 刘楠;苏云金芽孢杆菌酪氨酸酶纯化、性质研究及其mel基因的克隆和表达[D];武汉大学;2004年
6 黄志鹏;苏云金芽孢杆菌WB9的研究[D];福建农林大学;2005年
7 罗兰;苏去金杆菌的分离、cry/cyt基因鉴定及杀线虫活性的研究[D];西北农林科技大学;2005年
8 黄天培;苏云金芽孢杆菌的重要功能基因[D];福建农林大学;2006年
9 郎志宏;苏云金芽孢杆菌cry8Ca2基因的活性分析及在转基因烟草中的表达[D];中国农业科学院;2005年
10 刘贵明;苏云金芽孢杆菌YBT-1520全基因组测序和比较基因组学研究[D];浙江大学;2008年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 郭巍;苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因克隆及表达的研究[D];东北农业大学;2000年
2 陈宇熹;高效杀蚊苏云金芽孢杆菌BRC-LLP29的发酵优化[D];福建农林大学;2010年
3 谢宇飞;苏云金芽孢杆菌010菌株chi36基因克隆、表达和活性测定[D];福建农林大学;2010年
4 魏蒂;PCR法鉴定苏云金芽孢杆菌菌株的杀虫晶体蛋白基因[D];中国科学院武汉病毒研究所;2001年
5 郑大胜;苏云金芽孢杆菌对甜菜夜蛾毒性的筛选及DL-5789菌株的研究[D];中国科学院武汉病毒研究所;2001年
6 伍赠玲;苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位[D];福建农林大学;2004年
7 牛桂兰;高毒效杀甜菜夜蛾苏云金芽孢杆菌WY-190和WY-197菌株的研究[D];中国科学院研究生院(武汉病毒研究所);2002年
8 王荣伟;苏云金芽孢杆菌NU-1、NU-2毒力提高与保护的研究[D];西北大学;2004年
9 张勇;苏云金芽孢杆菌luxS基因的克隆表达及对植物抗病的影响[D];华中师范大学;2004年
10 邱思鑫;苏云金芽孢杆菌高效菌株的选育、发酵培养与添加剂筛选[D];福建农林大学;2001年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026