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《东北农业大学》 2001年
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猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-la株基因组解析及其囊膜蛋白结构与功能分析

仇华吉  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是二十世 纪八十年代末发现的一种高度传染性疾病,引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖 障碍,以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道疾病。其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒 (porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),系单股正链RNA病毒,与 马动脉炎病毒、鼠乳酸脱氢酶增高症病毒和猴出血热病毒同为最近成立的动脉炎病毒科 (Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。PRRSV基因组长约15kb,包括8个 开放阅读框架(ORF),ORF1a和ORF1b编码病毒复制酶;ORF2~5分别编码病毒的糖蛋 白GP2~5;ORF6编码膜蛋白(M蛋白);ORF7编码保守性的核衣壳蛋白(N蛋白)。根 据抗原性差异将各地PRRSV分离株分为欧洲型(原型毒株为LV)和北美洲型(原型毒株 为VR-2332)。 1995年,我国首次在北京地区大规模爆发PRRS,随后从流产胎儿体内分离出一株 PRRSV,命名为CH-la株。为了弄清流行于我国猪群的PRRSV的来源和遗传学背景,并 为进一步研究疫苗防制此病提供依据,本文测定了我国分离的第一株PRRSV CH-la株的 基因组全序列,利用序列分析软件对各基因和非编码区进行了分析,并与欧美标准毒株作 了比较,绘制了其系统发育进化树。结果表明,CH-la株基因组全长15 432个碱基(b), 编码8个开放阅读框架,5′非编码区(NCR)长190b,3′NCR长151b,其后是20b的polyA, ORFla编码的多聚蛋白经切割后生成6个非结构蛋白(Nspα、Nspβ、Nsp2~5),ORFlb编 码的聚合蛋白又可切割生成4个非结构蛋白(RdRp、CP2-4),ORFla与ORFlb之间的衔 接区为核糖体移码区,有保守的基序5′UUUAAAC3′和拟节结构。CH-la株与VR-2332 和LV 5′NCR核苷酸同源性分别为93%和63%,3′NCR分别为95.4%和78.2%,ORF2~7 与VR-2332和LV ORF2~7的核苷酸同源性分别在91.5~95.3%和63.5~70.2%,氨基酸同源 性分别在88.6~97.6%和61.2~81.0%。这表明CH-la株与流行于北美洲型毒株遗传关系很 近,而与欧洲型毒株遗传关系较远,表明流行于我国的PRRSV可能来自北美洲,同时CH-la 株与VR-2332也有一定的差异,可能分别属于北美洲型中的不同亚型。 囊膜蛋白GP5是PRRSV的主要结构蛋白和免疫保护性抗原之一,有许多独特的生物 学和免疫学功能,在致病和免疫机制中发挥着重要的作用。鉴于此,我们随后用真核表达 系统对之进行了体外表达,并对其功能作了初步探讨。 伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)是α疱疹病毒成员,其庞大的基因组中含有 多个非必需基因,如TK基因、gE基因、gG基因等,具有开发成病毒活载体的巨大潜力。 PRV Bartha-K61株就是gE缺失的疫苗株,为了缺失TK基因以进一步降低其毒力,并探 讨外源基因在PRV中表达的可行性,本文构建了通用PRV转移载体以及表达PRRSV GP5 基因的重组PRV。首先提取Bartha-K61株基因组,用KpnI充分消化,回收并克隆其KpnI 仇华吉 PRRSV CH.la株基因组解析及其囊膜蛋白结构与功能分析 2001年 5月 J片段,然后亚克隆其中的Kphl-Pstl片段,缺失重组质粒中的EcOAI位点和NOtl-Hindlll 片段,再用Accl切去378hp,在此缺失位置插入来源于pCR3-Uni的CMV启动子、多克 隆位点和 BGH polyA信号,构建了通用 PRV转移载体 pBdTK-Uni。然后,将来源于 pSTK (其中含有 PRV BamHI-门片段)的 1.7kb apnl片段(含有部分 TK及其下游同源序列) 将 PngSV GPS基因插入此通用转移载体中,构建成 GPS干RV转移质粒,经纯化与 Bartha-K6 株基因组 DNA共转染 PK-15细胞,经反复筛选和蚀斑纯化后获得了表达 PRRSV GPS基因的重组伪狂犬病病毒 rPRV-GPS,为开发 PRV/PngSV H价基因工程疫苗, 以及基于此的多价疫苗奠定了基础。 昆虫杆状病毒表达系统是一种良好的真核表达体系,以其忠实高效表达而广泛应用于 外源基因的体外表达及结构与功能研究。本研究将GPS基因定向亚克隆到杆状病毒转移载 体 pBlueBacHis B上,经鉴定、纯化后,与杆状病毒线性化 DNA(Bac-N-Blue’“DNA)共 转染Sfg昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒rHISBS。用PngSV特异性 抗血清进行的间接免疫荧光试验显示,在rHisBS感染的sfg细胞周围可见特异性的兔疫荧 光。SDS-PAGE和 WCstern blotting分析表明,GPS蛋白基因在杆状病毒系统中获得了表达, 其分子量大小分别为22、25和30ku,占细胞蛋白总量的26.4%。重组GPS蛋白可望用作 PRRS亚单位疫苗,作为病毒活载体疫苗的补充。 为了分析该基因功能和研制PugS基因疫苗,本文将PRRSV CH-la株Ogys亚克隆 至真核表达载体pCR3-Uni的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒。以该质粒转染 MARC.145细胞,可诱导其发生以DNA断裂和核小体形成为特征的细胞凋亡,同时证实 用ORFS基因免疫接种小鼠可诱导其产生特异性抗体应答,为PugS基因免疫提供了依据。 总之,本研究解读了Pn
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S852.65

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 卢晓艳;猪繁殖与呼吸综合征病毒遗传变异分析及猪α干扰素的真核表达[D];河南农业大学;2011年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 魏海明;重组杆状病毒/昆虫细胞表达体系及其在免疫学中的应用[J];国外医学(免疫学分册);1997年06期
2 魏振明,程由铨,李怡英,林道宝,翁文林;伪狂犬病毒弱毒株培育的研究[J];中国兽医科技;1986年08期
3 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
4 仇华吉,童光志,郭宝清,王柳,张绍杰,王玫,于力,刘宝全;猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株N基因的分子克隆、序列测定及其比较分析[J];中国畜禽传染病;1998年04期
5 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力;猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定[J];中国兽医学报;1998年02期
6 王云峰,周艳君,仇华吉,钱平,蔡雪晖,柴文君,童光志;应用重组N蛋白-ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究[J];中国兽医杂志;2001年03期
7 仇华吉,童光志;新型伪狂犬病疫苗及其评价[J];中国兽医杂志;1999年07期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 吴家强,颜世敢,胡北侠,任素芳,黄艳艳,张秀美;细胞培养对PRRSV-SD分离株滴度的影响[J];山东农业科学;2002年06期
2 张任娜;覃志初;帅领;刘晓燕;王豪举;;鸭瘟病毒的分离与鉴定[J];安徽农学通报;2007年20期
3 刘澜;;荧光PCR技术在动物医学中的应用[J];安徽农学通报;2008年23期
4 张家好,马伏泉;鸡减蛋综合症病毒在鸭胚中增殖规律的研究[J];安徽农业科学;2001年01期
5 赵瑞宏,潘孝成,张小飞,张丹俊,陈鑫;肥东县长临爆发幼鸭鸭瘟的调查与分离鉴定[J];安徽农业科学;2001年06期
6 金光明,杨倩;猪繁殖与呼吸综合症免疫学研究[J];安徽农业科学;2003年01期
7 沈咏舟;;新城疫病毒的进化与基因分型[J];安徽农业科学;2006年20期
8 袁章;郭万柱;余光勇;陈弟诗;;猪伪狂犬病毒载体的研究进展[J];安徽农业科学;2007年06期
9 廖列如;张林;孔庆波;刘国权;张淼涛;;犬冠状病毒的分离及鉴定[J];安徽农业科学;2007年30期
10 梁望旺;杨克礼;伍锐;刘泽文;熊忠良;徐涤平;;猪繁殖与呼吸综合征病原学研究进展[J];安徽农业科学;2007年36期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 冷超粮;安同庆;田志军;;猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
2 唐娜;曲光刚;王金良;苗立中;肖跃强;张倩;沈志强;;山东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离鉴定及ORF4、ORF5基因遗传特性分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 孔宁;高继明;马玉萍;赵钦;王承宝;肖一红;周恩民;;高致病性PRRSV感染处于不同细胞周期Marc-145细胞的比较分析[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
4 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];第十届中国科协年会论文集(三)[C];2008年
5 张利娜;张改平;唐志鹏;温建新;席俊;;PRRSV ORF6基因的克隆与真核表达载体的构建[A];河南省畜牧兽医学会第七届理事会第二次会议暨2008年学术研讨会论文集[C];2008年
6 刘欣晏;冯卫国;吴春涛;;牛传染性鼻气管炎病的研究进展[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
7 彭军;李顺成;王树明;牛钟相;;孔雀低致病性禽流感病毒株的分离与鉴定[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
8 沈美艳;崔宝玉;牛钟相;朱瑞良;张广斌;;ELISA双抗体夹心法检测鸡传染性腺胃炎[A];山东农业微生物技术学术研讨会论文集[C];2006年
9 孔繁德;王荣;陈琼;吴德峰;徐淑菲;;多重RT-PCR一步法技术同时检测猪瘟病毒和蓝耳病病毒方法的建立以及初步应用[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式,促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年
10 杨桂梅;高洪;徐自忠;花群义;周晓黎;;水泡性口炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的检测方法研究[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十三次学术讨论会和中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十二次学术讨论会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
2 姚美玲;H9N2亚型禽流感病毒气溶胶发生与传染机制及其感染SPF鸡的特点[D];山东农业大学;2010年
3 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
4 李红;CD163及其它蛋白在PRRSV感染细胞过程中的相互作用[D];山东农业大学;2011年
5 邢凤;猪抗PRRSV相关基因的鉴定及功能分析[D];山东农业大学;2011年
6 张德庆;C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D];山东农业大学;2011年
7 王刚;高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株感染所致的免疫损伤及免疫调控机理[D];山东农业大学;2011年
8 姜举娟;PRRSV HuB1株的分离鉴定及甘草酸体外抗PRRSV感染的研究[D];东北林业大学;2010年
9 郝晓芳;甘肃省猪繁殖障碍性疾病病毒性病原的分子流行病学调查及HP-PRRSV DNA疫苗的研究[D];中国农业科学院;2011年
10 田德斌;嵌合动脉炎病毒构建及其病毒学特性[D];中国农业科学院;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 宋飞;猪圆环病毒2型(WH株)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒混合感染致病性的研究[D];华中农业大学;2010年
2 定明;牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D];华中农业大学;2010年
3 李燕;猪干扰素刺激基因ISG20的克隆、真核表达及其对PRRSV增殖的影响[D];华中农业大学;2010年
4 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
5 肖犟;PRRSV对断奶仔猪生产性能和免疫力相关指标的影响[D];华中农业大学;2010年
6 王艳伟;PRRSV感染激活RANTES产生的信号通路研究[D];华中农业大学;2010年
7 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
8 史平玲;猪FcγRⅢ介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];郑州大学;2010年
9 孟祥珍;潍坊地区猪“高热病”流行病学调查和防控[D];山东农业大学;2009年
10 孙洪磊;整合禽网状内皮组织增生病病毒基因的鸡痘病毒分子生物学鉴定及致病机理研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 姜平,陈溥言,姜志华,蔡家利,董永毅,蔡宝祥;我国两个不同地区猪繁殖和呼吸综合征病毒分离株ORF5基因序列比例[J];病毒学报;2000年01期
2 闫若潜,吴文学,夏春,李新生;Mx蛋白研究进展[J];动物医学进展;2004年06期
3 范旭;李伟娟;刘玉松;徐红运;张凤华;赵琳;段志刚;夏平安;崔保安;;猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的遗传变异分析[J];河南农业大学学报;2010年02期
4 钱绩虎,邵荣标,丁昌慧,严建国,汤权,朱金阳,曹树梅;IFN-α对人体液免疫功能调节作用的实验研究[J];南通医学院学报;1999年02期
5 马静云;李浩波;王玲玲;何晓明;王连想;谢青梅;毕英佐;;高致病性PRRSV的分离及其Nsp2和ORF5基因的序列分析[J];中国兽医科学;2008年08期
6 郝友华;叶笛;张正茂;杨东亮;;人ISG20基因的克隆、真核表达及其抗HBV效应的初步研究[J];中国免疫学杂志;2006年10期
7 贾因棠;魏来;蒋栋;丛旭;费然;;干扰素刺激基因ISG20真核表达载体的构建及其抗丙型肝炎病毒复制作用的研究[J];中国免疫学杂志;2006年11期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 高志强;猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析[D];中国农业大学;2003年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前4条
1 初秀;国外猪伪狂犬病研究的概况[J];中国兽医科技;1985年12期
2 郭宝清,陈章水,刘文兴,崔益洙;从疑似PRRS流产胎儿分离PRRSV的研究[J];中国畜禽传染病;1996年02期
3 仇华吉,童光志,郭宝清,王柳,张绍杰,王玫,于力,刘宝全;猪生殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-la株N基因的分子克隆、序列测定及其比较分析[J];中国畜禽传染病;1998年04期
4 仇华吉,郭宝清,童光志,刘文兴,于力;猪繁殖 - 呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定[J];中国兽医学报;1998年02期
【相似文献】
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1 方芳,潘卫,崔晓红,宋艳斌,朱诗应,戚中田;中国人丙型肝炎病毒囊膜蛋白2HVR_1 cDNA的序列分析[J];第二军医大学学报;1997年03期
2 陈少莺,胡奇林,俞伏松,程晓霞,林天龙,李怡英,程由铨;猪伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物的制备[J];动物医学进展;2002年03期
3 梁风霞;谢建新;丁明孝;翟中和;;辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记[J];电子显微学报;1990年03期
4 陈少莺,胡奇林,程晓霞,俞伏松,陈仕龙,林天龙,程由铨,林锋强,朱小丽;伪狂犬病病毒囊膜蛋白ISCOMs免疫原性测定[J];中国预防兽医学报;2003年06期
5 吴金美,吕鸿声,吴祥甫,S.B.Braunagel,MDSummers;苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白ODV-E18的核定向转运研究[J];病毒学报;2000年03期
6 许信刚,胡建和,张彦明,邓宏魁北京大学生命科学学院;逆转录病毒载体介导的HCV囊膜蛋白基因的表达及动物免疫试验[J];中国病毒学;2004年06期
7 张萍,庞义,杨波,李朝飞,尹崇,苏德明;杆状病毒Splt MNPV SL136蛋白的功能[J];生物化学与生物物理学报;2002年03期
8 周飞;任建林;董菁;;乙型肝炎病毒囊膜蛋白候选结合蛋白的研究进展[J];世界华人消化杂志;2008年16期
9 王清华;王喜军;胡森;步志高;;重组杆状病毒表达裂谷热囊膜蛋白的研究[J];中国预防兽医学报;2006年01期
10 张春莉,施定基,黄倢,张海霞,彭国宏;白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建[J];海洋科学;2003年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 吴金美;S.B.Braunagel;M.D.Summers;;苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白OV-E18的核定向转运机制研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展(下册)[C];1999年
2 崔治中;张志;杜岩;;我国肉用型鸡群中J亚群白血病流行现状及中国株与参考株病毒间囊膜蛋白同源性比较[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
3 秦爱建;刘岳龙;金文杰;;囊膜蛋白糖基化作用对J亚群禽白血病病毒的影响[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集[C];2002年
4 梁风霞;谢建新;丁明孝;翟中和;;辛德毕斯病毒囊膜蛋白的免疫标记[A];第六次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1990年
5 肖昌;涂长春;;猪瘟病毒囊膜蛋白抗原表位的研究进展[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
6 寸树健;孙孜孜;吴文言;;白斑综合症病毒囊膜蛋白的分子生物学研究[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
7 吴金美;S.B.Braunagel;M.D.Summers;;苜蓿尺蠖核型多角体病毒囊膜蛋白OV-E18的核定向转运机制研究[A];第七届全国生物膜学术讨论会论文摘要汇编[C];1999年
8 毛文富;欧阳晓光;庞义;钟江;苏德明;;斜纹夜蛾杆状病毒与寄主中肠细胞相结合的一个囊膜蛋白[A];走向21世纪的中国昆虫学——中国昆虫学会2000年学术年会论文集[C];2000年
9 谈莹;姜凌;王曼丽;尹飞飞;邓菲;刘买利;胡志红;王华林;;杆状病毒囊膜蛋白融合肽的NMR结构和功能研究[A];第十五届全国波谱学学术会议论文摘要集[C];2008年
10 肖庚富;;病毒囊膜蛋白介导病毒与细胞膜融合的分子机制及融合抑制剂[A];湖北省暨武汉市生物化学与分子生物学学会第八届第十七次学术年会论文汇编[C];2007年
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1 庄愉;分子生物学对新药研究开发的影响[N];中国医药报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘玉林;斑点叉尾鮰病毒囊膜蛋白的鉴定及定位研究[D];华中农业大学;2012年
2 许信刚;逆转录病毒载体介导的丙型肝炎病毒(HCV)囊膜蛋白基因的表达及抗HCV中和抗体的研究[D];西北农林科技大学;2005年
3 王志民;对虾白斑病毒(WSSV)囊膜蛋白蛋黄抗体及凋亡抑制基因ORF390R的研究[D];武汉大学;2004年
4 任艳;牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E2与牛胚胎滋养层细胞相互作用的分子机制研究[D];石河子大学;2010年
5 王轶南;对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选[D];中国海洋大学;2008年
6 史利军;西尼罗病毒核酸及抗体检测体系的建立与评价[D];华中农业大学;2008年
7 田德斌;嵌合动脉炎病毒构建及其病毒学特性[D];中国农业科学院;2011年
8 孙玉苗;白斑综合征病毒(WSSV)三种重要囊膜蛋白的重组表达及在病害防控中的作用[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2012年
9 董罡;猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测[D];吉林大学;2013年
10 杜华华;对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因的表达及其重组蛋白抗病性研究[D];浙江大学;2006年
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1 张考;猪繁殖与呼吸综合征病毒通过囊膜蛋白E激活猪肺泡巨噬细胞炎性体[D];河北农业大学;2013年
2 解飞霞;对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28与对虾鳃细胞膜蛋白的分离和结合活性分析[D];中国海洋大学;2003年
3 白华;猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究[D];西北农林科技大学;2007年
4 王清华;裂谷热诊断与免疫防制技术的研究[D];内蒙古农业大学;2005年
5 王平;严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒核衣壳蛋白和囊膜蛋白E的重组表达及其单克隆抗体制备[D];第四军医大学;2005年
6 孟璐;白斑综合征病毒(WSSV)重复单元ORF94的序列差异分析及囊膜蛋白的相互作用[D];南京农业大学;2011年
7 李青龙;抗WSSV囊膜蛋白单抗的中和效果研究[D];中国海洋大学;2009年
8 郭露玲;传染性造血组织坏死症病毒全长囊膜蛋白的原核表达及病毒的电镜观察[D];华中农业大学;2009年
9 李红霞;对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜基因vp19、vp28的克隆、融合表达及中和抗体的制备[D];武汉大学;2004年
10 龙燕;对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜基因vp28、鲤鱼生长激素基因GH的克隆和表达[D];武汉大学;2005年
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