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《东北农业大学》 2001年
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抗真菌病基因对葡萄植物遗传转化的研究

孟岩  
【摘要】:葡萄生产一直是我国农业生产的一个重要的组成部分。近年来我国的葡萄栽培面积迅速扩大,葡萄生产发展迅速但病虫害种类也随之增多,尤其是真菌病害发病十分严重。植物基因工程近些年来发展迅速,利用基因工程技术培育抗病虫害作物新品种已成为作物育种的一个有效手段。葡萄遗传转化中已有许多可以利用的目的基因,但对葡萄进行遗传转化较困难,主要存在以下问题: 1.葡萄再生频率低是造成葡萄遗传转化困难的关键所在,器官发生易产生嵌合体,胚状体诱导不仅过程繁琐、漫长、诱导率低,而且受基因型的限制,仅少部分葡萄品种能产生体细胞胚。 2.对葡萄进行遗传转化较困难,迄今为止在葡萄中仅获得了较少的转基因植株,且导入的基因多为报告基因。 3.共培养及共培养后受体材料容易产生坏死,因此限制了农杆菌法转化的进行。 4.在筛选过程中,用卡那霉素对葡萄组织筛选选择效果不佳。 本研究针对葡萄遗传转化中存在的上述问题进行研究,采用欧洲种葡萄Semillion作为试材,建立其高效植株再生体系,并采用农杆菌介导法及基因枪法进行抗真菌病基因的遗传转移,探讨影响基因转移效率的主要因子,优化遗传转化条件,得到PCR检测阳性植株,为从根本上解决真菌病害,得到葡萄抗真菌病的转基因植株奠定了坚实的基础。本研究主要内容如下: 1.建立了体细胞胚胎发生途径植株再生体系。利用欧洲种葡萄Semillion的胚性愈伤组织,诱导体细胞胚胎发生,综合考虑三方面因素——体细胞胚萌发率、萌发的幼苗中完整植株的比率及畸形苗比率,将Nitsch+BA0.2mg/L+NAA0.02mg/L确立为最适合体细胞胚萌发培养基。生根培养基确立为附加0.04mg/LNAA的Nitsch培养基。 2.建立了悬浮培养体系。胚性细胞团悬浮培养最适培养基为ND培养基,在继代后4天将细胞团经孔径1mm的钢质筛网多次过滤处理,可以使体细胞胚胎发生的整齐度大大增强。经过筛处理的细胞团,在Nitsch培养基中培养5周后子叶型胚的比率可以高达92.1%,而且再生苗的畸形苗的百分率下降至38.5%。再生阶段最适培养基为附加1g/L活性炭的Nitsch培养基,活性炭的添加对减少畸形苗的发生是有利的。 3.绘制了胚性悬浮培养细胞生长曲线,曲线呈S型,悬浮培养细胞从第4天开始进入快速生长期,到第10天左右生长逐渐减慢,进入停滞期。由此可以选择细胞生长最佳时期进行遗传转化,这将有助于转化率的提高。 4.确立了适合于葡萄转化体筛选的抗生素的种类及浓度:在卡那霉素、G418、新霉素三种氨基葡糖苷类抗生素中,新霉素筛选效果最佳。培养5周后的细胞团在80mg/L的新霉素的选择压力下增殖为0,在此基础上进一步确立最佳筛选方式:在转化后用含 盂岩 摘 要.221年11月 80mg/L新霉素的固体培养基筛选或在将新霉素浓度由 30mg/L-50mg/L—S0mg/L逐步 提高的固体或液体培养基均可得到较好的筛选效栗。 5.探讨了影响遗传转化效率主要因素。 a.研究了不同菌株对转化的影响,通过调查抗性芽产生效率确立对葡萄材料侵染能 力强的菌株类型和对之敏感的受体材料类型。结果是 EHA 05的侵染能力显著高于 LBA4404。胚性愈伤较胚性培养细胞更为敏感。 b.通过对影晌转化的几个主要因子的正交试验,并对正交试验结果进行分析,确定 当试验组合为试验材料为大细胞团、菌液OD。=0.6、共培养4天、共培养培养基pHS.2 时为最优试验组合。这正好和本试验中试验5的结果相吻合。通过极差分析,确立各因 素的主次颇序为:共培养培养基叫值>植物材料>菌液浓度>共培养时间。本试验中最主 要的影响因素是共培养培养基pH值。 C研究酚类化合物对转化的影响,共采用了 5种酚类化合物,三种浓度(stheg/l。 100mg/l、150mg/l)处理葡萄胚性愈伤组织,以每 50mg愈伤组织经 GUS色后所产生的 蓝点数作为遗传转化效宰的指标,试验结果表明,乙酝丁香酮的效果远远好于其他处理, 差异显著性达极显著水平。 d.研究负压处理对转化的影响,研究发现,对于某一特定植物材料来讲,农杆菌侵 染时采用不同的真空强度处理不同时间,对GUS瞬间表达率会产生不同的影响。其中, 对于胚性愈伤来讲,采用0刀6M邯处理15分钟,**s瞬间表达率显著高于对照:对于 悬浮培养细胞而言,采用0.06/Mpe处理5分钟,GUS瞬间表达率显著高于对照。除此 之外,其它处理下的GUS瞬间表达率均显著低于对照。 6.对防止共培养及共培养后愈伤组织褐化问题进行研究,发现不同转化过程对愈伤 褐化的影响极大,在转化时将二次活化菌液离心后去上清,侵染时用YEB培养基重悬并 稀释一定倍数,侵染后转人共培养培养基中共培养。愈伤共培养后在除菌用液体培养基 中先振荡培养30分钟,静置后用移液器吸去上清,再用液体除菌培养基洗涤,用无菌滤 纸吸于后在固体除菌培养基中继续培养,可以使愈伤褐化率降至0。另外,采用聚乙烯 毗咯烷酮(PVP)等5种抗氧化剂,考查不同抗氧化剂对减轻愈伤侵染后褐化的作用。 发现除PVP对减轻褐化效果不显著外,其它抗氧化剂均对褐化
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S943.2

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 张丽;王敬东;宋玉霞;;农杆菌介导的葡萄转化研究进展[J];生物技术通报;2012年02期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 胡文冉;油葵再生体系的建立及转天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因的研究[D];新疆农业大学;2006年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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7 张晓东;李利斌;宋宜现;李化银;刘立峰;高玲;高建伟;;大白菜高效稳定遗传转化体系的建立[J];山东农业科学;2010年02期
8 刘媛媛;张春庆;吴承来;;LeJA2基因沉默表达载体导入番茄转化系统的建立[J];山东农业科学;2010年02期
9 梁水美;高洁;孟鹏;郭凤芝;黄承彦;李根英;李斯深;;不同小麦品种的潮霉素耐受性研究[J];山东农业科学;2011年02期
10 何春梅;张成华;刘强;董瑞;高新学;汪黎明;刘铁山;;转基因玉米PCR检测体系的优化研究[J];山东农业科学;2011年06期
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10 杨广东;李艳娥;上官晓霞;;大白菜遗传转化系统优化的研究[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 刘红梅;农杆菌介导百子莲抗寒基因CBF1高效转化体系的建立[D];华中农业大学;2010年
4 魏礼玲;MYB转录因子家族相关EST干涉载体构建及遗传转化的研究[D];华中农业大学;2010年
5 刘冉冉;枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究[D];华中农业大学;2010年
6 俞艳栋;杞柳瘿蚊的生物学特性及防治技术研究[D];安徽农业大学;2010年
7 徐红明;小麦抗白粉病相关基因的克隆与分析[D];郑州大学;2010年
8 徐娟;农杆菌介导的Ac/Ds转座系统转化甘蓝型油菜的研究[D];郑州大学;2010年
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10 刘无双;拟南芥种子特异表达基因启动子分析[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前7条
1 毛碧增;几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转基因水稻抗病性的研究[D];浙江大学;2001年
2 杨成德;农杆菌介导的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化黄瓜的方法研究[D];甘肃农业大学;2001年
3 陆万香;根癌农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转入甘蓝型油菜[D];西南农业大学;2001年
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【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 任芳;范旭东;董雅凤;张尊平;王教敏;;葡萄A病毒外壳蛋白基因克隆及分子变异分析[J];分子植物育种;2012年05期
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中国硕士学位论文全文数据库 前8条
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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6 本报记者 侯美丽;好葡萄酒从种出好葡萄开始[N];中国经济时报;2009年
7 本报记者 彭波;哭泣的葡萄[N];云南经济日报;2010年
8 本报记者 张华;我市“葡萄游”富有“钱”景[N];青岛日报;2010年
9 通讯员 汪进 杨成;澧县葡萄“枝翠果壮”[N];常德日报;2010年
10 贾明静;葡萄早产丰产有措施[N];科学导报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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7 杨怀义;草莓果实膜联蛋白基因的cDNA克隆及其遗传转化的研究[D];沈阳农业大学;1999年
8 梁机;转rolB基因改良毛白杨生根能力的研究[D];北京林业大学;2004年
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10 尹淑萍;草莓栽培品种离体再生及遗传转化的研究[D];中国农业大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 包爱科;AVP1基因转化紫花苜蓿的初步研究[D];兰州大学;2006年
4 蒿燕;利用人工microRNA技术构建CHSJ基因沉默载体及适于矮牵牛转化株系的筛选[D];西南大学;2010年
5 王海朋;桑树转景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因(MSBPase)的研究[D];山东农业大学;2011年
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7 贾海燕;农杆菌介导小麦遗传转化体系的建立及转基因研究[D];山东农业大学;2003年
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