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《东北农业大学》 2003年
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NDV La Sota与V4株对鸡T细胞亚群影响及其F蛋白抗原优势表位的比较研究

孙建宏  
【摘要】: 新城疫(NDV) La Sota和V4疫苗是新城疫防制中最为常用的两种疫苗,但是实践应用和研究中发现,尽管在诱导产生体液免疫应答方面La Sota优于V4疫苗,V4疫苗却能产生与La Sota疫苗相似的免疫效果。是什么机制导致这种现象的出现,一直困扰着人们。为从根本上阐明其中的机制,优化现有疫苗,更好的防制ND,我们在体液免疫和粘膜免疫研究的基础上,进一步应用流式细胞技术对NDV La Sota与V4株免疫鸡及免疫攻毒鸡CD4~-T、CD8~-T细胞亚群动态变化进行了比较。结果表明,总体上V4疫苗免疫后外周血和脾脏中CD4~-T细胞、CD8~-T细胞百分含量高于La Sota组,提示V4株诱导的T细胞免疫应答要优于La Sota株,进而从细胞免疫方面揭示了两种疫苗激发的免疫应答的差异。试验还表明新城疫La Sota、V4疫苗免疫后1天,外周血中的CD4~-T细胞明显增加,即激发了细胞介导的免疫反应,因此在疫苗免疫后抗体产生前,细胞免疫在对强毒攻击中可能发挥着重要的作用。 由于La Sota和V4疫苗免疫所激发的免疫应答存在着差别,为进一步探讨这种差别所在,本试验又开展了NDV La Sota和V4株特异性抗原表位的筛选和活性鉴定。 本研究应用亲水性、可及性和二级结构预测等5种参数对新城疫La Sota和V4株F蛋白的B细胞抗原表位进行了综合预测;采用Margalit的AMPHI法则等3种预测方案对La Sota、V4株的F蛋白T细胞抗原表位进行了综合预测。预测到二者的F蛋白B细胞抗原表位分别有19个,T细胞抗原表位有24个。比较发现,两个毒株有9个预测的B细胞表位氨基酸序列存在差异,有11个预测的T细胞表位氨基酸序列存在差异。 在此预测结果基础上,我们进行了表位的鉴定、筛选和比较研究。首先利用RT-PCR方法扩增并克隆了我国目前使用的NDV La Sota疫苗株F基因全序列,其包含了F基因完整的开放阅读框架(全长1662bp),与国外发表的La Sota疫苗株F基因核苷酸序列同源性高达99.8%。将两毒株F基因预测存在差异的表位,根据序列位置邻近合并分成6段表位区,以构建的La Sota疫苗株F基因和本课题保存的V4株F基因为模板,分别对每个毒株的6段表位区进行了亚克隆,构建了每个毒株的6个预测区的表达载体,对每个毒株的5个预测区进行了表达。5段多肽的大小分别是,P1:8.0KD、P2:10.8KD、P4:11.SKD、P5:13.5KD、P6:10.5KD。应用建立的Tricine缓冲体系5%-20%线性梯度聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳对表达情况进行了分析,证明所表达的肽段主要以包涵体形式存在,并成功地用Ni-NTA胶对其进行了纯化。 分别应用自制的La Sota与V4特异性抗血清,利用Western Blot对表达的各肽段 东北农业大学农学博士学位论文 一 (PIP6)进行了抗原性鉴定。结果n、P4、PS、P6段呈阳性反应,说明其中含有线性B 细胞表位。这4段分别位干F蛋白的148aa、201-274aa、377-458aa、469-530aa,以前 发现的中和性表位均不在这4段区域内。而PZ段在Western Blot中无抗体反应性,表明 它不含线性表位。比较研究发现ADV La Sota与V4株的*、P4区的B细胞表位活性存在 着重要的差异,这两段分别存在于*、FZ i白上距离融合肽均较近的超螺旋区,这种差 异可能造成两个毒株的免疫原性差异。 为进一步研究各表位肽段的兔疫原性及不同毒株的差异情况,我们将含有重要易变位 点 37Saa的La Sota PS与V4 PS段纯化多肽及两种灭活疫苗免疫16日龄的SPF鸡,结果 La Sota、V4灭活疫苗组和 V4全病毒+La Sota PS组诱导产生了高水平的抗体,而 La S。ta PS及V4 PS段免疫组与空白对照组无显著差异,说明这两段多肽只有免疫反应性而无免 疫原性。应用RT-PCR方法检测鸡体内IFNry的mnyA表达量,结果表明IFN7的mRNA表 达量均较低,且各免疫组与主白对照组均无显著差异,可能提示它们均不能有效的激发鸡 体的NDV特异的T细胞反应。 本试验结果首次对NDV La Sota PS与V4株的细胞免疫和抗原表位差异进行了全面系 统的比较研究,证实了 V4疫苗株激发细胞免疫应答的功能优于 La Sota,阐明了两疫苗 免疫特点不同的理论基础,并初步证实产生免疫原性差异的分子基础在于抗原表位的不 同,为进一步精细的研究两个毒株的抗原表位、找到二者优势抗原表位的差异,以探索二 者免疫机制的不同,研制集合两毒株不同优势表位特点的表位DNA疫苗奠定了重要的基 矗出。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S858.31

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【参考文献】
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