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《东北农业大学》 2003年
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乳源抗高血压生物活性肽在大肠杆菌中表达的研究

吕桂善  
【摘要】: 课题背景: 高血压是一种慢性的心脑血管疾病,是冠心病,脑卒中等心脑血管疾病的主要危险因素。据统计,全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1200万,高血压病已成为人类健康的第一杀手,成为全球性的重大的公共卫生问题。目前,世界卫生组织(WHO)批准用于治疗高血压病的一线药物主要有利尿剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、钙通道阻滞剂(CaA)、α受体阻断剂、血管紧张素(Ang)受体拮抗剂等六大类。 研究表明,肾素-血管紧张素系统(RAS)在机体的血压调节过程中起着十分重要的作用。在该系统中,ACE酶是血压调节过程中一个关键的酶,它可以将无活性的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)水解生成具有血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),从而导致血管收缩,机体的血压升高。ACEI可抑制ACE酶的活性,从而抑制了AngⅠ向AngⅡ的转化,使机体血压维持恒定。因此,ACEI在治疗高血压病中的应用也越来越广泛。但是使用药物治疗都有一定的副作用,所以,寻找安全的、天然的、食物来源的ACEI物质来治疗高血压引起了广大科学家们极大的关注。 有研究报道,在牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离到了一些在体外具有ACE酶抑制活性、经动物实验(体内实验)证明具有降低血压作用的抗高血压生物活性肽。这一研究结果引起了科学家们的极大兴趣,极大地促进了乳源抗高血压小肽的研究。然而,到目前为止,所有的乳源抗高血压小肽都是通过蛋白酶对乳蛋白质的水解获得的,还没有通过基因工程技术来表达抗高血压小肽的研究报道。 研究目的: 本课题的研究目的是研究乳源抗高血压生物活性肽CEI_(12)在大肠杆菌中的表达情况,探讨采用基因工程技术大量生产乳源抗高血压生物活性肽CEI_(12)的可能性。 方案设计: 本研究根据文献已经公开发表的、在体内外实验中证明具有降血压作用和ACE酶抑制活性的、来源于牛乳酪蛋白的一段被称为CEI_(12)的多肽氨基酸序列(Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)及遗传密码,人工合成了一段双链DNA分子(5’CGCGGATCCCGCTTCTTTGTGGCGCCGTTCCCGGAAGTTTTCGGCAAAGGATCCAGA 3’),经酶切后与融合表达载体pQE16连接,转化到大肠杆菌E.Coli JM109、E.ColiBL21和E.Coli DH5α中。从转化的平板中筛选出阳性重组子,进行不同IPTG浓度和不同诱导时间的表达研究,并利用SDS-PAGE电泳和Western blotting蛋白质印迹技术对外源基因CEI_(12)在大肠杆菌E.Coli.JM109、E.Coli.BL21和E.Coli.DH5α中的表达情况进行检测分析。最后对重组菌的生长条件、生长曲线、发酵条件和表达产物的体外生物学活性进行了研究。 东北农业大学工学博士学位论文 一 研究结果: 外源基因CEllZ在大肠杆菌E.C。h.JM109和E.C。h.BLZI中获得了一定量的表达, 而在大肠杆菌 E.COlt.DHS Q中没有表达。在大肠杆菌 E.C。h.JM109中的表达量约为 500 Pgh培养液,在大肠杆菌ECOliBLZI中的表达量约为1二t培养液。 经用不同的IPTG浓度对重组大肠杆菌E.C。h.JM109和E.C。h.BLZI进行诱导表达 发现,不同的IPTG浓度诱导对外源基因CEllZ的表达量影响不大,不同的诱导时间对外 源基因CEll。的表达水平也无明显影响。经对重组大肠杆菌E.C。h.BLZI进行长时间的 诱导表达发现,当诱导时间为 12小时时,外源基因 CEI;。的表达量最大,但与第 6小时 的表达量差异不大。 不同的碳源对重组菌PQE16+JM109的生长影响较大,但所试验的各种碳源,其增 菌作用都比不上酵母粉对重组菌 PQE16+JM109的增殖效果好;有机氮源对重组菌 pQE16+JM109的生长促进作用明显比无机氮源好,在有机氮源中,大豆蛋白陈对重组菌 nQE16+JM109的增值效果最好,可代替胰蛋白陈使用;除 pnoz外,不同的培养基洲 对重组菌 pQE16+JM109 的生长的影响不大。综合以上三方面的结果,重组菌 PQE16+JM109的最佳的培养条件是 LB培养基,pH72。 重组菌(+QE16+JM109和 pQE16+BLZI)的生长曲线表明,重组菌在开始的几个小 时内生长速度明显低于对应的空白菌ECOli.JM109和E.C。h.BLZI,但后期的生长速度 明显高于空白菌,总的说来,重组菌的生物量更大些。 不同的碳源对重组菌PQE16+JM109生长曲线的几个阶段和发展趋势没有明显的影 响,但对其生物量有较大的影响,除酵母粉外,山梨醇也是一种可行的碳源;除硫酸按 外,不同的氮源对重组菌pQE16+JM109生长曲线的几个阶段和发展趋势及生物量没有 明显的影响,大豆蛋白陈是重组菌PQE16+JM109的良好氮源,是比较理想的胰蛋白豚 的代替品:不同出的培养基对重组菌的m60M109生长曲线的几个阶段、发展趋势基 本没有影响,生物量相差也不大,说明培养基的 pH对重组菌 pQE16+JM109的生长影响 不大。通过调整LB培养基中酵母粉和胰蛋白陈的浓度,发现酵母粉浓度为15%,胰蛋 白陈浓度为1%时重组菌PQE16+JM109的生长情况比较好。 两重组菌(pQE16+JM109和pQE16+BLZI)的生长曲线的对比说明,其生长曲线及 发展趋势基
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q78

【引证文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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