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《东北农业大学》 2003年
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禽流感病毒(H9N2亚型)NS基因的克隆及表达载体的构建

孙进华  
【摘要】: 禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种禽传染病,于1878年首次在意大利暴发流行。禽流感主要表现为,高致病力毒株致鸡只的大量死亡,非高致病力毒株引起产蛋量下降,免疫功能障碍而继发细菌或病毒的感染。自1994年首次报道禽流感在中国流行以来,禽流感H9N2亚型已成为中国当前的主型。禽流感病毒H9N2亚型引起的禽流感的报道最早见于1966年,感染火鸡主要表现为轻度的上呼吸道症状。但自90年代开始,H9N2禽流感病毒对鸡的危害越来越严重,除引起上呼吸道障碍、产蛋量严重下降外,个别毒株还引起了较大的死亡。因此,开展对禽流感病毒H9N2亚型毒力的研究,无论在病毒学,还是在兽医学等学科上均具有重要的学术意义。 本实验用接种鸡胚的病毒增殖方法获得了A/Chicken/Mudanjiang/0823/00(H9N2)分离株的大量增殖,增殖病毒经差速离心进行纯化,经超迷离心浓缩。根据Genbank发表的AIV NS基因核苷酸序列,设计1条通用引物T-1,进行反转录获取cDNA;然后再设计特异性引物NS1-u/NS1-1、NS2-u/NS2-1、HNS2-u用以扩增非结构蛋白NS1、NS2、HNS2,通过PCR技术,从病毒基因反转录产物cDNA中扩增出病毒非结构蛋白NS1、NS2完整基因片段,通过巢式PCR法扩增出HNS2片断,直接与pMD 18-T克隆载体连接。提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及分析。结果表明:禽流感病毒分离株NS1基因全长654bp,编码217个氨基酸,与国外已发表的禽流感病毒A/Chick/HongKong/1074/99(H9N2)、A/Chick/HongKong/1073/99(H9N2)毒株的核苷酸同源性皆为94.37%,氨基酸同源性分别为89.6%和89.1%,末端有13个氨基酸缺失。与国内株比较,核苷酸同源性皆在89-98%之间,氨基酸同源性在78-88%之间,进化树分析表明分离株与香港株同处在一个亚分支内,亲缘关系较近。HNS2基因全长为336bp,编码111个氨基酸。与香港株比较核苷酸同源性分别为94.63%、94.33%,氨基酸序列同源性分别为95.50%和94.59%。 从含有禽流感病毒分离株非结构蛋白基因的重组质粒pMD18-T-NS1中切取NS1、HNS2基因片段,分别将其亚克隆于pGEX-6p-1的BamH Ⅰ、Xho Ⅰ位点和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ位点上,然后经单、双酶切及质粒PCR鉴定,结果表明目的片段基因成功插入表达载体中。构建出含有NS1基因的表达载体和含有HNS2基因的表达载体,为进一步研究AIV非结构蛋白的功能及其与宿主细胞的相互作用机制奠定了分子生物学基础。
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