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《东北农业大学》 2003年
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t-PA基因对黄瓜的遗传转化及其在不同植物中的表达效率分析和密码子改造

柏锡  
【摘要】: 组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,t-PA)是一种高效特异的溶血栓药物,被广泛地应用于血管栓塞性疾病的治疗。目前t-PA已经在大肠杆菌生物体中成功表达并产业化,但生产成本昂贵。由于植物表达系统具有生产成本较低、表达产物安全性高、便于大规模生产和储运等特点,因此以转基因植物为生物反应器生产t-PA目前已成为研究热点。但植物表达系统存在外源基因表达量低的问题,极大地限制了转基因植物在基因工程药物生产上的应用。 本研究以黄瓜为生物反应器,进行t-PA的表达。针对外源基因表达量低的问题,对t-PA基因进行了重新设计,并将新设计的t-PA基因转化黄瓜,获得了转基因PCR阳性植株;同时对马铃薯、黄瓜和草莓的密码子用法进行分析,预测了t-PA基因在3种生物体中的表达情况,进行了适于植物中表达的t-PA基因密码子改造。主要结论如下: 1.t-PA基因设计 (1)在基因转录水平上 将t-PA基因置于增强子E12和CaMV 35S启动子调控之下,构建了植物表达载体pBET和pBEMT。增强子E12是将CaMV 35S启动子上游-419~-90区域重复2次所构成的序列,该序列可使CaMV 35S启动子在双子叶植物中的启动效率提高70倍。 (2)在翻译水平上 通过PCR扩增的方式在t-PA基因起始密码子处添加了植物翻译起始共有序列AACA,构建了植物表达载体pBET。植物翻译起始共有序列与动物体中的Kozak序列具有相同的功能,能够加速mRNA的翻译起始。 (3)翻译后水平 通过PCR扩增的方式在t-PA基因5′端添加了真核分泌信号肽序列和植物翻译起始共有序列AACA,在3′端添加了内质网定位序列KDEL,构建了植物表达载体pBEMT。真核分泌信号肽序列可以引导新合成的蛋白质进入内质网腔,KDEL序列将进入内质网腔的蛋白质锚定在内质网内壁上,从而阻断了蛋白质进入高尔基体和细胞质的过程,进而避免了外源蛋白质的异源糖基化修饰,延长了蛋白质在生物体内的半衰期。 2.黄瓜遗传转化 将上述结果中的植物表达载体pBET和pBEMT转化黄瓜获得PCR阳性植株。 (1)黄瓜子叶节植株再生建立 东北农业大学理学硕士学位论文 一 ①通过对比三种外植体(于叶、子叶节、下胚轴)的分化率,得出最佳外植体类型为 子叶节; ②通过探讨 PGR(NAA、6-BA)浓度和配比对不定芽分化的影响,得出最佳芽诱导 培养基为:*卜1*叭6。*A(…5.8): (2)黄瓜遗传转化 ①通过探讨 e浓度对不定芽分化率的影响,确定 XITI筛选浓度为 30mg/L。 ②以LBA4404(pBET)对黄瓜的遗传转化,得到56棵抗性植株(抗性芽率25刀%)。 ③以LBA4404(pBEMT)对黄瓜的遗传转化,得到59棵抗性植株(抗性芽率33.5%)。 3.抗性植株的分子生物学检测 门)KR检测转化卜*A基因的抗性植株32株,得到12株叮R阳性植株,阳性率为37.5%。 检测转化mt-PA基因的抗性植株36株,得到18株PCR阳性植株,阳性率为50刀%。 (2)Southern blot检测了 3株转化 mtPA基因的植株,得到 1株 Southern blot阳性植株, 并且为单拷贝整合。 4.植物密码子分析和t-PA表达预测 (l)合作编写了生物密码子分析软件 CODON ANALYSE。 (2)检索了马铃薯、黄瓜和草萄编码蛋白基因 CdS序列,进行密码子用法分析,获得了 3种植物密码子用法表和高表达优越密码子。 门)根据CBI值预测了卜PA基因在3种植物中的表达情况,结论是原始t.PA基因适合 在草萄中表达,在马铃薯和黄瓜中表达较低。因此,在卜PA基因表达的受体植物 选择上,选择草毒较好;如以马铃薯和黄瓜为受体进行卜*A基因的表达,应对该 基因进行受体植物偏爱密码子改造。 (4) 为提高t-PA基因在马铃薯和黄瓜中的表达水平,对卜PA基因CdS序列进行密码子 改造,获得了分别具有马铃薯密码子使用特点和黄瓜密码子使用特点的t-PA基因 序列。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q943.2

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