鸡传染性支气管炎病毒国内分离株基因组的研究

【摘要】： 鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。其临 床诊断特征为病鸡咳嗽，喷嚏，气管啰音；幼鸡流鼻涕，蛋鸡产蛋量及蛋品质下降。各 日龄、品种和性别的鸡均易感。目前，在我国IB的发生已经遍布华北、华南、西北、西 南和东北等大部分省、市和自治区，虽然已广泛使用IB疫苗，但IB的发生仍然普遍存 在，尤其是在已免疫鸡群中又常常爆发IB，给养殖业造成严重的经济损失。 IBV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的代表种。其基因 组为单股线状正链RNA'，有感染性，大小约为27.6kb，具有3′poly A尾和5′帽状结 构(cap)。在感染细胞内可检出6种亚基因组mRNAs(1-6)，现已确定mRNA 2、4、6 分别编码IBV的3个主要结构蛋白——纤突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、 核衣壳蛋白(Nucleocapsid．N)；而mRNA1包含两个开放阅读框(Open Reading Frame， ORF)，即ORF1a和ORF1b，可编码440KD和300KD的蛋白。但在通常情况下，下游 的ORF1b可通过核糖体移框(Frameshifting)与上游的ORF1a形成分子量约为750KD 的多聚蛋白(Polyprotein)pplab，然后再被细胞内蛋白酶裂解为相应的功能蛋白。 本研究主要对已经分离鉴定的三株IBV毒株LH2／01／10(黑龙江肾型株)、D971(大 连“腺胃型”株)和LX4(新疆肾型株)进行基因分析。首先在10龄SPF鸡胚中增殖 病毒，当病毒尿囊液血凝价稳定在256以上时，纯化和浓缩病毒，再经反转录-聚合酶链 式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)技术扩增目的基因。 本研究首先对三株毒株的主要结构基因进行了克隆和序列测定。设计引物时将5a、5b 和N基因，3a、3b、3c与M同时扩出。构建了结构基因N、M、S和3c(E)和非结构 基因3a、3b、5a和5b的基因进化树。序列测定表明三者的N基因均由1230bp组成， 无碱基的缺失与插入，但存在点突变，编码409个氨基酸(AA)，且与国内分离株同源 性均较高，而在某些基因区与H120和H52同源性可达100％。N基因进化树显示 LH2／01／10、LX4在同一群内，而D971却与国外参考毒株更近，表明三者在不同地区经 历不同的进化，导致不同基因特征的出现。M基因长度不同，LH2／01／10为687bp(228 个AA)、D971为681bp(226个AA)、LX4 678bp(225个AA)，M基因保守程度也较 高，进化树表明三者亲缘关系与国内毒株近，与国外毒株及疫苗株相对较远。S蛋白是 IBV最重要的免疫原，尤其S1部分可刺激机体产生保护性的中和抗体，而S1基因在基 因组中变异频率最高。S基因序列分析表明，LH2／01／10与LX4的S基因为3495bp，编 码1164个AA，S蛋白的切割识别位点为5个连续的碱性氨基酸残基组氨酸-精氨酸-精 氨酸-精氨酸-精氨酸(His-Arg-Arg-Arg-Arg，HRRRR)，为IBV中国分离毒株所独有。 二者的S1基因均为1614bp，编码539个AA；D971S为3498bp，编码1165个AA，切 割识别位点为NSRRR，该序列为所选参考毒株中最为独特的一个。D971S1为1614bp，编 码538个AA，S2为1884bp，编码627个AA。S1基因分析表明不同国家的IBV毒株差 异显著，LH2／01／10与LX4在同一群内，与H120和H52等疫苗株相对较近，而与国外 东北农业大学农学博士学位论文 变异株D1466和DEO72等群仅36%同源。D971独树一帜，与国外参考毒株相近，这再 次证明D971的独特进化史。E基因是近年来研究发现的IBV的另一个结构基因， LHZ/0l/1 oE基因为336bp，0971为309bp，Lx4为330bp，三者均表现在3’端变异频 繁，与参考毒株一致。进化树分析表明，LHZIO 1/10与Lx4在同一大群内，而D971却 远离大部分参考毒株，与上述sl基因的进化结果一致. 非结构基因3a、3b、5a和5b的序列结果表明，三者的5a和5b基因数目分别一致. sa均为198bP，编码65个AA，sb为249bp，编码82个^^。3a基因二者也相同，为 174bp，编码57个^^。LHzlo一/lo3b为x89bP，编码62个AA;o9713b为195bp，编码 64个AA;LX43b为192bP，编码63个AA，在第60位LH功1/10与Lx4均缺少D。 3a基因分析表明LX4进化独特，单列一个分支，而D971与国外变异株GA/98相近， LHZ/0 1/10与BJ亲源关系近。3b基因进化树与sl和3c一致。5a和5b进化关系一致， 参比的国内毒株在同一群内。 LX4 mRNA 15’端独特区序列测定使该毒株成为国内首次完成全基因序列测定的 IBV地方分离株.LX4 mRNAI由19940bp组成，包含2个ORF，即ORFla和ORFlb。其 中LX4 ORFla为11916个by，编码3971个AA.LX40RFlb为7950bp，编码2649个AA。 在LX40RFla和ORFlb之间有74bp间隔.具有与Beaudette毒株相同的“滑脱序列” 竹TAAAC，保证聚合蛋白pPlab的形成。LX4“假结”的第2环第7位与Beaudette相比， 由G突变为A，但基本结构不变，不影响该区域的功能。 综上所述，本研究分析了三株毒株结构基因N、M、sl和E基因的变异特征，同 时也对非结构基因3a、3b、3c、5a和sb基因进行了国内的首次构建分析。Lx4的全基 因序列的测定是国内首次对工BV地方分离株的