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鸡传染性支气管炎病毒国内分离株基因组的研究

刘玉芬  
【摘要】: 鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病。其临 床诊断特征为病鸡咳嗽,喷嚏,气管啰音;幼鸡流鼻涕,蛋鸡产蛋量及蛋品质下降。各 日龄、品种和性别的鸡均易感。目前,在我国IB的发生已经遍布华北、华南、西北、西 南和东北等大部分省、市和自治区,虽然已广泛使用IB疫苗,但IB的发生仍然普遍存 在,尤其是在已免疫鸡群中又常常爆发IB,给养殖业造成严重的经济损失。 IBV属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的代表种。其基因 组为单股线状正链RNA',有感染性,大小约为27.6kb,具有3′poly A尾和5′帽状结 构(cap)。在感染细胞内可检出6种亚基因组mRNAs(1-6),现已确定mRNA 2、4、6 分别编码IBV的3个主要结构蛋白——纤突蛋白(Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)、 核衣壳蛋白(Nucleocapsid.N);而mRNA1包含两个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),即ORF1a和ORF1b,可编码440KD和300KD的蛋白。但在通常情况下,下游 的ORF1b可通过核糖体移框(Frameshifting)与上游的ORF1a形成分子量约为750KD 的多聚蛋白(Polyprotein)pplab,然后再被细胞内蛋白酶裂解为相应的功能蛋白。 本研究主要对已经分离鉴定的三株IBV毒株LH2/01/10(黑龙江肾型株)、D971(大 连“腺胃型”株)和LX4(新疆肾型株)进行基因分析。首先在10龄SPF鸡胚中增殖 病毒,当病毒尿囊液血凝价稳定在256以上时,纯化和浓缩病毒,再经反转录-聚合酶链 式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术扩增目的基因。 本研究首先对三株毒株的主要结构基因进行了克隆和序列测定。设计引物时将5a、5b 和N基因,3a、3b、3c与M同时扩出。构建了结构基因N、M、S和3c(E)和非结构 基因3a、3b、5a和5b的基因进化树。序列测定表明三者的N基因均由1230bp组成, 无碱基的缺失与插入,但存在点突变,编码409个氨基酸(AA),且与国内分离株同源 性均较高,而在某些基因区与H120和H52同源性可达100%。N基因进化树显示 LH2/01/10、LX4在同一群内,而D971却与国外参考毒株更近,表明三者在不同地区经 历不同的进化,导致不同基因特征的出现。M基因长度不同,LH2/01/10为687bp(228 个AA)、D971为681bp(226个AA)、LX4 678bp(225个AA),M基因保守程度也较 高,进化树表明三者亲缘关系与国内毒株近,与国外毒株及疫苗株相对较远。S蛋白是 IBV最重要的免疫原,尤其S1部分可刺激机体产生保护性的中和抗体,而S1基因在基 因组中变异频率最高。S基因序列分析表明,LH2/01/10与LX4的S基因为3495bp,编 码1164个AA,S蛋白的切割识别位点为5个连续的碱性氨基酸残基组氨酸-精氨酸-精 氨酸-精氨酸-精氨酸(His-Arg-Arg-Arg-Arg,HRRRR),为IBV中国分离毒株所独有。 二者的S1基因均为1614bp,编码539个AA;D971S为3498bp,编码1165个AA,切 割识别位点为NSRRR,该序列为所选参考毒株中最为独特的一个。D971S1为1614bp,编 码538个AA,S2为1884bp,编码627个AA。S1基因分析表明不同国家的IBV毒株差 异显著,LH2/01/10与LX4在同一群内,与H120和H52等疫苗株相对较近,而与国外 东北农业大学农学博士学位论文 变异株D1466和DEO72等群仅36%同源。D971独树一帜,与国外参考毒株相近,这再 次证明D971的独特进化史。E基因是近年来研究发现的IBV的另一个结构基因, LHZ/0l/1 oE基因为336bp,0971为309bp,Lx4为330bp,三者均表现在3’端变异频 繁,与参考毒株一致。进化树分析表明,LHZIO 1/10与Lx4在同一大群内,而D971却 远离大部分参考毒株,与上述sl基因的进化结果一致. 非结构基因3a、3b、5a和5b的序列结果表明,三者的5a和5b基因数目分别一致. sa均为198bP,编码65个AA,sb为249bp,编码82个^^。3a基因二者也相同,为 174bp,编码57个^^。LHzlo一/lo3b为x89bP,编码62个AA;o9713b为195bp,编码 64个AA;LX43b为192bP,编码63个AA,在第60位LH功1/10与Lx4均缺少D。 3a基因分析表明LX4进化独特,单列一个分支,而D971与国外变异株GA/98相近, LHZ/0 1/10与BJ亲源关系近。3b基因进化树与sl和3c一致。5a和5b进化关系一致, 参比的国内毒株在同一群内。 LX4 mRNA 15’端独特区序列测定使该毒株成为国内首次完成全基因序列测定的 IBV地方分离株.LX4 mRNAI由19940bp组成,包含2个ORF,即ORFla和ORFlb。其 中LX4 ORFla为11916个by,编码3971个AA.LX40RFlb为7950bp,编码2649个AA。 在LX40RFla和ORFlb之间有74bp间隔.具有与Beaudette毒株相同的“滑脱序列” 竹TAAAC,保证聚合蛋白pPlab的形成。LX4“假结”的第2环第7位与Beaudette相比, 由G突变为A,但基本结构不变,不影响该区域的功能。 综上所述,本研究分析了三株毒株结构基因N、M、sl和E基因的变异特征,同 时也对非结构基因3a、3b、3c、5a和sb基因进行了国内的首次构建分析。Lx4的全基 因序列的测定是国内首次对工BV地方分离株的


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