鹅细小病毒VP3基因的克隆、序列比较及原核表达

【摘要】： 鹅细小病毒(Goose Parvovirus，GPV)为细小病毒科细小病毒属成员，它引起雏鹅发生 以急性肠炎及肝、肾、心实质器官炎症为特征的烈性传染病—小鹅瘟。GPV致病性强，所 致疾病死率高，对养鹅业的危害严重。我国学者方定一1956年首先发现了本病，并分离出 GPV。在此之后，国外许多国家相继分离到该病毒，证实了该病毒在世界范围内有较为广 泛的分布。VP3为GPV的主要结构蛋白，占病毒结构蛋白的80％，是主要免疫保护性抗 原。因此，对VP3基因及其产物的研究对小鹅瘟的防制有重要理论价值和实践意义。 本实验根据Zadori等发表的GPV B株基因序列合成了扩增GPV主要结构蛋白VP3基 因的上下游引物GF\GR。利用这对引物，分别将来自国内的4个GPV毒株，通过PCR技 术从病毒基因组DNA中扩增出病毒VP3完整基因片段，将之与pMD18-T质粒载体连接， 转化感受态大肠杆菌TG1，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，对插入片段进行序列 测定及比较分析。序列测定结果为：4个GPV毒株的VP3基因全长均为1605bp，编码534 个氨基酸。序列分析比较表明，不同毒株VP3基因同源性较高(95.64％～99.81％)，而强弱 毒株之间有5个氨基酸存在共性差别。 另设计一对带有酶切位点的PCR扩增引物，对其中1株GPV的VP3基因重新进行了PCR 扩增，并将PCR产物克隆到pMD18-T质粒载体。经酶切鉴定和序列测定后，再将带有粘性 末端的VP3基因片段亚克隆到pGEX表达载体系统的pGEX-6p-1质粒，构建了原核表达载 体pGEX-6p-VP3。将pGEX-6p-VP3再转化表达宿主BL21(DE3)plysS，经IPTG诱导，成功地 表达了带有融合蛋白GST的VP3(GST-VP3)。SDS-PAGE分析表明，利用pGEX表达载体系统 所表达的GST-VP3，分子质量约为88ku，其中VP3约为58ku。 本实验在基因和分子水平上说明了VP3基因的保守性和GPV单一血清型的分子生物 学基础，并为进一步研究VP3蛋白的理化特性和分子生物学特性提供了必要的条件。这为 确立GPV的分类地位及其进化关系的研究提供了依据，同时为研制GPV基因工程疫苗和 分子诊断试剂奠定了坚实的工作基础。