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《东北农业大学》 2004年
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Bt抗虫基因导入马铃薯的遗传转化研究

苏俊峰  
【摘要】:本研究通过基因工程手段, 利用农杆菌介导法将Bt基因导入马铃薯品种大西洋, 同时对马铃薯品种大西洋、地西瑞、东农303和克新4号的茎段和叶片再生体系进行优化,建立了马铃薯高效再生体系和遗传转化体系, 探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的因素, 确立了最佳植株再生体系和遗传转化条件,获得了转基因植株。主要研究结果如下: 1马铃薯再生体系的建立 ⑴ 茎段最佳愈伤培养基为:MS+0.1 mg/l 2,4-D+1mg/l BA;最佳分化培养基为:MS+1mg/l GA3+1mg/l ZT。叶片最佳愈伤培养基为: MS+0.2mg/lNAA +5mg/l GA3 +2.25mg/l BA;最佳分化培养基为:MS+5mg/l GA3+2.25mg/lBA。 ⑵ 基因型不同,在相同侵染条件下的愈伤诱导率差异较大。大西洋的愈伤率最高,茎段为68.76%,叶片达75.11%。 ⑶ 以相同的农杆菌菌株介导不同类型外植体,外植体分化率不同。本试验采用茎段和叶片作为遗传转化的外植体材料,最佳外植体为叶片。 2 遗传转化影响因素探讨 (1) 茎段外植体最佳预培养时间为2d,此时抗性愈伤率最高,为56.78%。最佳共培养时间为2d,抗性愈伤率最高为50.10%。叶片外植体最佳预培养时间为2d,此时抗性愈伤率最高,为71.25%。最佳共培养时间为3d,此时抗性愈伤率最高,为70.00%。 (2) 侵染时间和菌液浓度因外植体类型而异,茎段外植体最佳侵染时间为10 min,此时抗性愈伤率最高,为54.62%,菌液浓度OD600=0.5时,抗性愈伤率最高为49.37%;叶片最佳侵染时间为10min,此时抗性愈伤形成率为63.69%,菌液浓度OD600=0.5时,抗性愈伤率最高为68.12%。 (3) 杀菌剂选用进口头孢噻肟钠。浓度为200mg/l时,可完全抑制菌的生长,且对外植体再生无影响。 (4) 抗性选择剂为卡那霉素(Kan)。在不同生长阶段,选择压力不同。在愈伤形成阶段,Kan的选择压力为50mg/l;在生根阶段,Kan的选择压力为75mg/l。 3 抗性植株的检测 WP=9 试验接种转化101个叶片,获得的大西洋再生植株经PCR检测和PCR-Southern杂交检测有3株呈阳性, 转化率为2.96%, 初步证明了目的基因以整合到了马铃薯基因组中。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S532

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