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《东北农业大学》 2004年
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黄瓜抗病基因同源序列的克隆及其对霜霉病抗病基因标记的研究

丁国华  
【摘要】:由古巴假霜霉菌(Pseudoperonospora cubensis Rostow)引起的黄瓜霜霉病(Downy mildew)是当前严重影响黄瓜生产的主要病害之一,1868年首次被发现,近年来日趋严重。防治霜霉病可采取喷施杀菌剂和高温闷棚等措施,但根本途径是培育抗霜霉病的黄瓜优良品种。克隆和标记黄瓜霜霉病抗病基因,则是当前利用分子技术进行抗病育种工作的基础。 本试验采用基于抗病基因同源序列(Resistance gene analog, RGA)克隆和标记基因的策略,主要进行了以下3方面的研究:(1)依据抗病基因的NBS保守域设计简并引物,从黄瓜基因组DNA中克隆RGA;(2)构建黄瓜抗感霜霉病分离群体,并用于从上述克隆到的RGA中筛选黄瓜霜霉病抗病基因的连锁标记;(3)利用获得的黄瓜RGA分析黄瓜的种质资源,考察RGA在黄瓜抗病种质资源上的聚类分析效果。 本试验首先参照文献报道,引用和设计了12条对应NBS类保守域P-loop、kinase2、kinase3a和HD等4个亚结构域的简并引物,采用SDS方法提取了黄瓜栽培品种津春4号和649的基因组DNA作为模板,通过PCR方法以及琼脂糖凝胶回收纯化技术,分别获得约270bp、340bp和540bp的目的扩增产物,将其与pMD18-T载体连接并转化JM109大肠杆菌,经过蓝白斑初步筛选,各自随机挑取72个阳性重组克隆进行菌培养和质粒提取,经过限制性酶切和PAGE方法分类,测序了其中60个克隆,经过在GenBank上使用Blast搜索和比对同源序列,最终确定其中15个克隆为黄瓜RGA片段,分别命名为CsRGA1~15,提交GenBank,获得登录号分别为AY555482~AY555495和AY545993。其中CsRGA5包含全部上述4个亚结构域,长度520bp;CsRGA2包含3个亚结构域,长度336bp;其余CsRGA只包含2个亚结构域,长度168~288bp。10个CsRGA为可完全翻译序列,5个CsRGA内部含终止密码,为不可完全翻译序列。使用PCR方法验证了全部CsRGA在供试样本基因组的存在。10个可通读CsRGA与公布的甜瓜RGA之间存在较高的同源性,显示出两者同属的亲缘关系。 为从CsRGA中筛选黄瓜霜霉病抗病基因标记,分别以631和L18为感病亲本、649和129为抗病亲本,构建了4个以631×649和L18×129为杂交组合的霜霉病抗感性状的自交和回交分离群体,使用基于CsRGA1~15设计的特异引物,在上述群体中进行常规PCR扩增,在琼脂糖凝胶上获得多态性电泳谱带;为考察筛选引物的标记效果,同时进行了已公布黄瓜霜霉病抗病基因SCAR标记SCBC519和SCBC526的PCR扩增和分析。群体内各单株的DNA采用SDS微量简易提取法提取,抗病等级采用子叶点滴人工接菌法鉴定。连锁分析使用MAPMAKER/EXP3.0版本分析软件。结果显示:L18×129 F2回交分离群体(L18为回交亲本)、631×649 F2自交分离群体(单株数86)和L18×129 F2自交分离群体(单株数77)的霜霉病抗感性状都有合适的分离比值(1:1和1:3),在L18×129 F2自交 WP=10 分离群体上得到较好的连锁标记,从15个CsRGA中筛选到与抗病基因dm连锁不十分密切的CsRGA3标记。在dm和CsRGA3之间还检测到黄瓜白粉病抗病基因pm的存在,显示了dm和pm存在连锁关系。 本试验为研究植物RGA在种质资源分析方面的效果,特别是标示抗感病品种资源的作用能力,选择了24个黄瓜主要栽培品种进行标记聚类分析。所使用的标记为CsRGA3、BC519和BC526等3种标记(后两者为已公布的dm的RAPD标记),采用普通PCR方法扩增产物,琼脂糖凝胶电泳观察多态性谱带,并使用MVSP 3.13分析软件对谱带进行UPGMA聚类分析,以70%相似性(similarity)为域值,将供试品种划分为4类。与黄瓜霜霉病人工接菌鉴定结果相对照发现,3个标记可以明确标示出高感霜霉病黄瓜品种(长春密刺和L18),但对中抗和高抗类型分辨不够清晰。表明此种专项种质资源的分析方法基本可行。 本试验在实验方法上有所创新。首次采用PCR-PAGE方法对RGA的克隆进行分类,与四碱基酶切分类方法相比较,该方法能够全面分析待测的克隆核苷酸序列,PCR扩增不受载体序列干扰、无需酶切鉴定可以直接去除非重组克隆,同时还可以对重组克隆进行是否为目的片段克隆的PCR验证。该方法在对电泳谱带的分析上也比较简便,只需对目的电泳带进行长度的归类,借助图象扫描分析软件可轻易完成。 综上所述,本试验证实了NBS类型RGA在黄瓜基因组中广泛存在,并与甜瓜RGA有较高同源性;本试验还初步验证了黄瓜RGA同某些抗病基因之间可能存在的连锁关系;本试验还首次尝试使用RGA的特异引物分析植物品种间的遗传关系,初步证明黄瓜RGA对抗病种质有一定的标示作用。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S642.2

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4 曲丽;秦智伟;;黄瓜白粉病病原菌及抗病性研究进展[J];东北农业大学学报;2007年06期
5 刘鸣韬,徐瑞富,牛立元,李新峥;多效唑提高黄瓜对霜霉病抗性的生理机制研究[J];北方园艺;1997年05期
6 尤丽群,刘文,赵文言;日光温室冬春黄瓜霜霉病防治技术[J];石河子大学学报(自然科学版);1996年03期
7 高必达,黄文坤,黄翅,巢进;6种杀菌剂对黄瓜霜霉病的田间药效比较[J];农药;2004年12期
8 孔秋香;保护地黄瓜霜霉病防治新法[J];河南科技;2002年12期
9 潘汝谦,古希昕;黄瓜不同品种对霸霉病的抗性研究[J];华南农业大学学报(自然科学版);1993年02期
10 ;点烧法巧治黄瓜霜霉病[J];长江蔬菜;2004年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 邱艳;马艳蓉;;宁夏银川冬季塑料大棚黄瓜霜霉病的发生与防治调查研究[A];中国植物病理学会2004年学术年会论文集[C];2004年
2 丁国华;秦智伟;;黄瓜NBS类序型抗病基因同源列的克隆与分析[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
3 程周超;顾兴芳;黄三文;张忠华;张圣平;苗晗;;黄瓜和甜瓜比较图谱的构建[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
4 任瑞星;王蕊;邢振建;许建德;;低温诱导在唐山秋瓜育种中的效果研究[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
5 王瑞;林毓娥;黄河勋;梁肇均;;华南型黄瓜雌性性状分子标记初报[A];庆祝中国园艺学会创建80周年暨第11次全国会员代表大会论文摘要集[C];2009年
6 张兴国;邓小燕;邵长文;孙涌栋;梅茜;苏承刚;;CBF3和Cor15A基因导入黄瓜[A];中国园艺学会第六届青年学术讨论会论文集[C];2004年
7 张兴国;邵长文;孙涌栋;苏承刚;;基因Cor15A和CBF3导入黄瓜基因组[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
8 杜胜利;韩毅科;魏爱民;张桂华;高述民;陈启民;;黄瓜离体雌核发育早期的特异蛋白研究[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年
9 邱淮海;;“微力特”液体生物菌剂在黄瓜上的肥效试验研究[A];江苏土壤肥料科学与农业环境[C];2004年
10 王永健;陈青君;张锋;;黄瓜遗传育种研究的现状和发展趋势[A];全国蔬菜遗传育种学术讨论会论文集[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 健康时报特约记者 陈锦屏 刘伟俊;吃黄瓜别扔黄瓜把儿[N];健康时报;2006年
2 潘继兰;培育黄瓜壮苗技法[N];新疆科技报(汉);2008年
3 袁国杰;黄瓜要根据叶片数量留瓜[N];河南科技报;2009年
4 高碑店市新城镇武家村 王建明;春小拱棚黄瓜后期管理经[N];河北科技报;2009年
5 晓虎;怎样防治黄瓜“花打顶”[N];保定日报;2009年
6 相子瑞 张磊;黄瓜育种富了后迟人[N];德州日报;2010年
7 蓝天;如何防止黄瓜味苦[N];山西科技报;2005年
8 陈秋娇;夏黄瓜高产栽培要领[N];山西科技报;2005年
9 永年报农种植专业合作社 吕志军 永年县西河庄乡善寨村 张学民;黄瓜主要病害的防治[N];河北农民报;2011年
10 谭家峰;佳蔬良药话黄瓜[N];民族医药报;2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 丁国华;黄瓜抗病基因同源序列的克隆及其对霜霉病抗病基因标记的研究[D];东北农业大学;2004年
2 万怡震;中国葡萄属野生种抗病性及抗病基因RAPD标记作图研究[D];西北农林科技大学;2003年
3 罗莎;禾本科中NBS-LRR类抗病基因的进化研究[D];华中农业大学;2012年
4 王绪霞;苎麻炭疽病菌的分离鉴定及抗病基因文库的构建[D];华中农业大学;2011年
5 缪旻珉;黄瓜(Cucumis sativus L.)热伤害与热适应生理机制及耐热栽培技术研究[D];南京农业大学;2000年
6 秦跟基;根据抗病基因保守区克隆小麦抗病基因及小麦抗赤霉病基因双单倍体作图群体的构建[D];南京农业大学;2001年
7 崔金霞;一氧化氮和MAPK在油菜素内酯诱导黄瓜抗氧化防御中的作用[D];浙江大学;2010年
8 谢皓;小麦外源抗白粉病基因的分子标记[D];中国农业大学;2005年
9 于锡宏;设施内黄瓜对重金属耐受机制的研究[D];东北农业大学;2000年
10 许莉萍;甘蔗抗感黑穗病池的构建和抗病基因分子标记[D];福建农林大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 段崇香;日光温室黄瓜有机基质栽培合理基质配方及需肥特性的研究[D];山东农业大学;2002年
2 王娟;黄瓜穴盘苗徒长机理及控制技术的研究[D];山东农业大学;2003年
3 陈彤;HBsAg S基因克隆及基因转化用黄瓜的组织培养[D];河北大学;2003年
4 徐宁;塑料大棚黄瓜白粉病和霜霉病流行预测和管理系统的研究[D];南京农业大学;2003年
5 张国广;农杆菌介导的Chi和Glu基因转化黄瓜的研究[D];华中农业大学;2004年
6 国艳梅;黄瓜苦味遗传规律研究及AFLP分子标记[D];东北农业大学;2003年
7 罗兵;壳聚糖对黄瓜品质、产量及蔗糖代谢的影响[D];南京农业大学;2003年
8 梅茜;黄瓜幼果cDNA文库构建与部分ESTs分析[D];西南农业大学;2004年
9 冯嘉玥;温室春黄瓜灌溉指标的研究[D];西北农林科技大学;2004年
10 杨慧玲;黄瓜工厂化育苗基质筛选[D];河南农业大学;2002年
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