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《东北农业大学》 2005年
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重组猪瘟病毒T细胞表位的猪细小病毒样颗粒亚单位疫苗研究

范京惠  
【摘要】:猪细小病毒(Procine parvovirus,PPV),属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属的成员,是引起母猪繁殖障碍(reproductive failure)的主要病原体之一。各种不同类型的猪均可感染,引起母猪发生流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。 猪瘟(Classical Swine Fever,CSF 或Hog Cholera,HC)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病,是危害养猪业的主要传染病之一。猪瘟除了可以引起败血症之外,还可引起一系列其它临床表现,如妊娠母猪流产、胎儿畸形、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统受损、继发或并发细菌或其他病毒感染等。而且各种年龄的猪均易感,给养猪业带来巨大的经济损失。因此,研制和开发具有良好的免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗来接种健康猪群和感染者具有重要的现实意义。 本研究以CSFV 的优势T 细胞表位E290(含CSFV 特异的辅助性和细胞毒性T 细胞表位)为基础,以PPV 的核衣壳蛋白VP2 基因为支架载体分子,来研制预防猪瘟和猪细小病毒病的病毒样颗粒疫苗的新思路,在国内外尚未见有类似报道。 首先,对分离的PPV 毒株LJL12,在PK15 细胞上进行增殖,根据Genbank 报告的参考毒株VP2 基因的核苷酸序列,利用Oligo 和Primer5.0 等软件,设计合成一对引物,以LJL12 的DNA 为模板,应用PCR 扩增出长约1.7Kb 的VP2 基因片段,将该基因片段克隆到pMD–18T 载体,并进行了酶切、PCR 鉴定和序列测定,并将测序结果与Genbank 报告的其他毒株VP2 基因进行序列比较,发现与其他毒株的核苷酸同源性均在99%以上,推导的氨基酸同源性均在98%以上,说明LJL12 株VP2 基因的保守性很高。 将从pMD-18T-VP2 中酶切纯化后的VP2 基因克隆至真核表达载体pMel BacA 的XhoⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上,命名为PM-VP2。酶切和PCR 鉴定结果表明,获得了PPV VP2 基因与pMel BacA 质粒的阳性重组子。 根据Brown 等报道的CSFV T 细胞表位E290 的基因序列,设计一对引物,使上下游引物之间重叠18 个碱基,并对酶促合成方式进行改良,采用普通的Taq 酶,扩增获得了大小约为60bp 多肽基因片段E290。将用酶促合成方法获得的E290 的基因,克隆至重组质粒PM-VP2 的VP2 基因5’端上游,并命名为PM-VP2-E290。对重组子PM-VP2-E290 进行酶切和序列测定,测定结果表明,扩增产物的序列与原设计的序列的同源性为100%。 纯化重组子PM-VP2-E290 阳性质粒,并与Bac-N-Blue DNA 共转染昆虫细胞sf9,96h后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA 分子的PCR 鉴定表明,获得了杆状病毒DNA 与E290-VP2 基因的重组子,命名为P-1 代病毒。将经过三次噬斑筛选纯化后的P-1 病毒接种于sf9 细胞上进行增殖,PCR 鉴定后完全纯化的病毒,命名为P-2 代病毒。并按同样方法制备高效价的P-3 代病毒,以备用于表达。 将高效价的P-3代重组杆状病毒接种于形成50%单层的sf9细胞,4天后收获病变细胞,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western-blot)和免疫酶斑点技
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.5

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 陈燕凌;PCV2 ORF2/PPV VP2核酸疫苗的构建及猪IFN-γ对其分子佐剂效应的研究[D];四川农业大学;2010年
【共引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
2 赵鹏;猪繁殖与呼吸综合征病毒在抗体选择压下的变异[D];山东农业大学;2010年
3 刘栋;畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D];山东农业大学;2010年
4 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
5 姚美玲;H9N2亚型禽流感病毒气溶胶发生与传染机制及其感染SPF鸡的特点[D];山东农业大学;2010年
6 宋翠平;H5N1禽流感和鹅Ⅰ型副粘病毒分离株的生物学特性及感染性的研究[D];中国海洋大学;2010年
7 张琪;KLT对中脑神经系统疾病的影响及KLT、NDV、SW联合抗肿瘤作用机制研究[D];西北农林科技大学;2010年
8 焦新安;重组卡介苗诱导T细胞免疫应答的分子、细胞机理研究[D];扬州大学;1999年
9 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
10 郭银汉;福州地区对虾病毒病的病原诊断及流行病学[D];福建农林大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
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4 胡智斌;湖北省高致病性猪蓝耳病活疫苗(JXA1-R株)试用报告[D];华中农业大学;2010年
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6 邬成业;禽流感病毒H5N1亚型河南分离株NP基因的原核表达及T细胞表位筛选[D];郑州大学;2010年
7 史平玲;猪FcγRⅢ介导PRRSV抗体依赖增强作用研究[D];郑州大学;2010年
8 邱莹;猪细小病毒的分离鉴定及NS1基因、VP2基因的克隆测序分析[D];山东农业大学;2010年
9 巩艳艳;抗体免疫选择压作用下新城疫病毒HN基因和F基因的变异[D];山东农业大学;2010年
10 孙洪磊;整合禽网状内皮组织增生病病毒基因的鸡痘病毒分子生物学鉴定及致病机理研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 韩新锋;串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及其免疫原性研究[D];四川农业大学;2008年
2 古小彬;兔疥螨虫株的分子分类及其疫苗研究[D];四川农业大学;2009年
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1 边席峰;猪圆环病毒2型ORF2基因的真核表达及间接ELISA方法的建立[D];四川农业大学;2005年
2 王笑笑;猪干扰素-γ和白介素-18基因在哺乳动物细胞中的表达与活性分析[D];甘肃农业大学;2007年
3 陈杨;PPV VP2基因重组PCV2 ORF2基因病毒样颗粒的获得与部分生物学特性研究[D];四川农业大学;2007年
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5 胡秋炅;PPV SC-1株VP2蛋白Cys-402、214的定点突变及其对PPV VLPs影响的初步研究[D];四川农业大学;2008年
6 郭春艳;猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其单克隆抗体的制备和鉴定[D];东北农业大学;2009年
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