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《东北农业大学》 2005年
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GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用

布日额  
【摘要】:小鹅瘟(Goose plague, GP)是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)所引起的主要侵害4~20 日龄雏鹅的急性或亚急性败血性传染病,其造成的死亡率高达90-100%,是危害养鹅业最严重传染病之一。自1956 年中国学者方定一在我国扬州地区发现并进行首次报道后,世界许多养鹅国家和地区均有陆续报道。GPV 属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)的成员。病毒整个基因组为5.1kb,含有两个阅读框,左侧阅读框编码NS1、NS2 非结构蛋白,右侧阅读框编码VP1、VP2 及VP3 结构蛋白,其中VP3 结构蛋白能够诱导机体产生中和抗体,因此VP3 基因片段是研究防治小鹅瘟基因工程苗和检测抗原的首选基因。 在防治小鹅瘟实践中,GPV 全毒疫苗曾发挥了重要作用,但全毒苗的应用的确存在散毒、潜伏感染,以及对GPV 自然感染与GPV 全毒苗免疫抗体无法进行鉴别等不足,致使该病长期以来无法得到有效检测,直接影响到对小鹅瘟的有效控制。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光抗体试验等血清学诊断方法,在一定程度上为防治小鹅瘟发挥了重要作用,但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足,已不适应更有效地控制该病的需要。国外学者建立了根据GPV 核酸PCR 产物酶消化片段的大小来区别小鹅瘟与番鸭细小病毒感染的方法,但未见进一步深入应用的报道。 本论文以建立完善、有效的分子生物学和免疫学检测方法,更加有效地控制小鹅瘟为目的,应用扩增GPV 部分核酸片段的特异性引物及其克隆产物分别研究和建立了对GPV DNA进行定性和半定量检测的PCR 及DIG 核酸标记探针方法。利用部分核酸片段的原核表达产物研究建立了定量及定性检测GPV 感染抗体及鉴别VP3 亚单位抗体的间接ELISA 及斑点ELISA 方法。本论文的研究内容和结果如下: 1. 克隆了GPV H1 株的VP1-VP3 核苷酸非重叠序列片段。测序结果为,克隆产物由534bp个核苷酸组成,编码178 个氨基酸残基。扩增产物测序结果与Gen Bank 公布的GPV B 参考毒株同区段序列同源性达100%。 2. 利用扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段的两对引物建立了检测GPV 核酸的PCR 方法。两对引物只扩增GPV 模板DNA,对GPMV、AIV 等对照病毒核酸模板的PCR 呈阴性。扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段引物分别能从系列稀释至4.4fg、44pg 或0.01LD50、10LD50的GPV 感染鹅脏器DNA 中扩增出GPV DNA。对7 组感染鹅脏器检测结果表明,两对引物均能快速、准确地扩增出病鹅脏器中的GPV DNA,阳性检出率达100%。2001-2004 年间对多起送检病鹅的PCR 检测均获得一致的结果。但由于扩增NS1 片段引物的检出灵敏度比扩增VP1-VP3 核酸片段引物低1000 倍,因此选择扩增VP1-VP3 核酸片段的一对引物作为建立GPV PCR 检测方法的特异性引物。由于PCR 具有强大的扩增效应,能够从病鹅脏器提取DNA中直接扩增GPV DNA,从而为准确地检测GPV 提供了一项快捷、有效的方法。 3. 对VP1-VP3 及NS1 核苷酸片段的扩增产物利用Digoxigenin 进行标记,建立了检测GPV 核酸的DIG 标记探针方法。两个标记探针均能与各自相应核酸片段PCR 产物、重组质粒及不同毒株的GPV 核酸发生特异性杂交,而与GPMV、AIV 核酸杂交呈阴性。VP1-VP3
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S852.65

【引证文献】
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2 于天飞;马波;邢明伟;靳淼;刘海暇;李俚;王君伟;;鹅细小病毒非结构蛋白和结构蛋白的二级结构及B细胞抗原表位预测[J];中国家禽;2007年07期
3 尚绪增;张雅为;王兆鹏;鞠环宇;马波;王君伟;;鹅细小病毒NS2蛋白间接ELISA方法的建立[J];中国预防兽医学报;2010年08期
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1 王倩;鹅细小病毒NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测方法的建立及应用[D];东北农业大学;2011年
2 杜秋明;鹅细小病毒单克隆抗体的制备及单抗双夹心ELISA检测方法的建立[D];延边大学;2011年
3 贺娟;鹅细小病毒特异PCR及其抗体间接ELISA检测技术的建立与应用[D];西南大学;2007年
4 荆志强;鹅细小病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[D];东北农业大学;2010年
5 郭鹭;抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及对应抗原表位的定位[D];东北农业大学;2010年
6 赵文婧;抗鹅细小病毒VP3蛋白单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸条的研制[D];延边大学;2012年
【共引文献】
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1 林树乾;何元龙;赵增成;李峰;;山东省鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和血清型分析[J];山东农业科学;2010年12期
2 李祥辉;黄大鹏;黄玉兰;;鸡抗小鹅瘟病毒IgY提取方法的比较试验[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年23期
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4 沈咏舟,沈乐平,程建整;鸡传染性支气管炎病毒冻干保护剂热稳定性研究[J];安徽农业科学;2003年06期
5 沈咏舟,沈乐平,程建整;鸡传染性法氏囊病病毒冻干保护剂热稳定性研究[J];安徽农业科学;2004年01期
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7 赵恒章,王天有,李国旺;鸡霍乱组织灭活苗的研究[J];安徽农业科学;2005年05期
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10 刘畅;牛桂玲;;鸡传染性鼻炎河南株分离鉴定及防治[J];安徽农业科学;2007年23期
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4 谢德焱;王利民;;鸡新城疫Ⅰ系疫苗制备及相关指标检验[A];吉林省畜牧兽医学会2007学术年会论文集[C];2007年
5 潘铁骊;张守峰;扈荣良;;几种理化因子对狂犬病病毒BD06分离株感染力的影响[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会成立大会暨第一次学术研讨会论文集[C];2008年
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7 徐丽敏;;油乳剂疫苗中去掉硬脂酸铝的工艺改进及效果评价[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年
8 宋振辉;郭万柱;;猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及全基因组序列分析[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
9 邹永新;肖智远;李剑荣;刘思伽;;复合中药免疫佐剂对鸽禽Ⅰ型副粘病毒病疫苗免疫效果的测定[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
10 贾英;王晓蒙;谢文强;;乳化剂在油乳剂疫苗生产中的添加方法研究[A];中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集[C];2008年
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1 姜中毅;猪传染性肝炎病毒的基因克隆及分子特征研究[D];甘肃农业大学;2009年
2 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
3 陈克研;猪血凝性脑脊髓炎免疫层析检测试纸及其灭活疫苗的研制[D];吉林大学;2011年
4 李晓燕;呼吸道病毒高通量悬浮芯片检测方法的建立及新现呼吸道病毒的分子特征分析[D];天津医科大学;2011年
5 姜中毅;猪传染性肝炎病毒的基因克隆及分子特征研究[D];甘肃农业大学;2010年
6 蒋桃珍;H3N8亚型马流感病毒的致病性研究及灭活疫苗的研制[D];华中农业大学;2010年
7 张义;突发公共卫生事件中政府应急管理研究[D];吉林大学;2011年
8 潘铁骊;狂犬病病毒BD06株生物学特性鉴定及反向遗传系统的建立[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年
9 焦新安;重组卡介苗诱导T细胞免疫应答的分子、细胞机理研究[D];扬州大学;1999年
10 姜永厚;新城疫病毒F基因与鸡IL-2重组DNA疫苗的研究[D];东北农业大学;2000年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
2 李强;张家口市鸡传染性法氏囊病毒VP2基因高变区变异性的研究[D];中国农业科学院;2010年
3 齐晓亮;鸡传染性支气管炎病毒核衣壳(N)蛋白的原核表达及其抗原性分析[D];新疆农业大学;2010年
4 卢龙娣;鸡源性益生芽孢杆菌的筛选鉴定、固体发酵的优化及其应用效果的研究[D];福建师范大学;2010年
5 刘霞;鸭源新城疫油乳剂灭活疫苗制备的研究[D];山东农业大学;2011年
6 张磊;鸡毒支原体JN株的分离鉴定及PCR检测方法的建立[D];山东农业大学;2010年
7 陈洪博;DF-1细胞分泌的外源体(Exosomes)在ALV-J免疫抑制中的作用[D];山东农业大学;2011年
8 张春岭;枣庄地区鸡新城疫流行病学调查与防制研究[D];山东农业大学;2011年
9 王栋;猪血凝性脑脊髓炎病毒经消化道感染的神经径路传播机制[D];吉林大学;2011年
10 臧德跃;猪血凝性脑脊髓炎病毒呼吸道感染模型的建立及其在体内的动态分布[D];吉林大学;2011年
【同被引文献】
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1 余祖华;丁轲;程相朝;张春杰;李银聚;吴庭才;;鹅细小病毒蛋白研究进展[J];安徽农业科学;2006年18期
2 孙素玲;;鸡传染性贫血病胶体金快速诊断试纸条的研制——鸡传染性贫血血清抗体的制备、纯化及检测[J];安徽农业科学;2008年12期
3 林彤;独军政;丛国正;邵军军;高闪电;常惠芸;谢庆阁;;胶体金标记免疫层析技术的最新应用进展[J];安徽农业科学;2010年16期
4 何光志;田维毅;钱宁;简昌友;安永如;;胶体金免疫层析法快速诊断犬弓首蛔虫病[J];安徽农业科学;2010年24期
5 胡晓静;潘杰;陈进喜;付薇;徐贤坤;何丹;刘棋;熊毅;;2株鹅细小病毒的主要结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析[J];现代农业科技;2008年23期
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8 程由铨,林天龙,胡奇林,李怡英,周文谟,吴振兖;雏番鸭细小病毒病的病毒分离和鉴定[J];病毒学报;1993年03期
9 娄华,白挨泉,顾万军,贺东生,杨德威,刘福安;番鸭细小病毒强、弱毒株VP2基因的序列测定比较[J];病毒学报;2001年02期
10 余兵,王永坤,刘宝荣,朱国强,严维巍,王建业;鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析[J];病毒学报;2002年03期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 周艳君;猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D];东北农业大学;2005年
2 于天飞;鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛选[D];东北农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李长瑜;小鹅瘟病毒单克隆抗体的制备及胶体金诊断试纸的研究[D];吉林农业大学;2006年
2 毕建敏;鹅细小病毒荧光定量PCR检测方法的建立与应用及其VP3基因序列分析[D];山东农业大学;2007年
3 郑义华;小鹅瘟单克隆抗体的研制及应用研究[D];安徽农业大学;2007年
4 于在江;马传贫病毒驴白细胞毒弱毒基质蛋白单克隆抗体的制备及其表位的初步鉴定[D];内蒙古农业大学;2007年
5 裴颖;感染鹅细小病毒雏鹅病理学研究[D];东北农业大学;2008年
6 李俚;抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定[D];东北农业大学;2008年
7 张雅为;鹅细小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA检测方法的建立及抗体消长规律的测定[D];东北农业大学;2008年
8 杜鑫;小鹅瘟病毒延边分离株VP3基因克隆及单管巢式PCR诊断方法的建立[D];延边大学;2008年
9 邢俊吉;鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D];中国农业科学院;2009年
10 王斌;流行性乙型脑炎病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及病毒特异性抗原表位鉴定[D];中国农业科学院;2009年
【二级引证文献】
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2 胡自立;刘海玲;张光明;张凯;高瑞娟;罗开健;;鹅细小病毒SS/10株VP3蛋白的原核表达及鉴定[J];动物医学进展;2012年05期
3 黎明;于天飞;徐爽;索荔;王傲;姚宇;彭亮;;基于生物信息学预测的番鸭细小病毒和鹅细小病毒免疫交叉反应研究[J];广东农业科学;2011年24期
4 马磊;董浩;蒋运博;段小波;谷松至;胡桂学;;鹅细小病毒研究进展[J];中国畜牧兽医;2011年06期
5 蒋运博;董浩;马磊;徐楠楠;段小波;胡桂学;;鹅细小病毒的分子生物学研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2012年05期
6 于天飞;朱红标;孙天国;张健;蔡雅璐;庞后琴;史小飞;;猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点分子特征分析[J];生物技术通报;2010年03期
7 于天飞;仇铮;马波;李俚;王君伟;;鹅细小病毒结构蛋白B细胞线性抗原表位的鉴定[J];生物技术通报;2010年07期
8 郭鹭;鞠环宇;于天飞;荆志强;马波;王君伟;;鹅细小病毒VP3蛋白B细胞线性表位的精确定位[J];畜牧兽医学报;2010年08期
9 肖治军;张改平;乔松林;赵东;李学伍;邓瑞广;杨艳艳;邢广旭;郅玉宝;杨继飞;柴书军;;Ⅰ型与Ⅱ型IBDV前体多聚蛋白B细胞抗原表位的预测与比较[J];中国家禽;2009年21期
10 鞠环宇;卫娜;尚绪增;荆志强;郭鹭;马波;王君伟;;鹅细小病毒野毒株VP3基因的原核表达及抗原性检测[J];中国兽医科学;2009年06期
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1 于天飞;鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛选[D];东北农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 马磊;GPV原位PCR和免疫荧光检测方法的建立及其在雏鹅体内定植研究[D];吉林农业大学;2011年
2 王倩;鹅细小病毒NS基因PCR和单抗竞争ELISA检测方法的建立及应用[D];东北农业大学;2011年
3 杜秋明;鹅细小病毒单克隆抗体的制备及单抗双夹心ELISA检测方法的建立[D];延边大学;2011年
4 李俚;抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定[D];东北农业大学;2008年
5 张雅为;鹅细小病毒VP3-ELISA和NS2-ELISA检测方法的建立及抗体消长规律的测定[D];东北农业大学;2008年
6 徐宗香;口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定[D];东北农业大学;2009年
7 仇铮;抗鹅细小病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及其对应抗原表位区分析[D];东北农业大学;2009年
8 王锐;基于杂交瘤细胞单链抗体制备技术的应用—抗GPV-NS1和GoIFN-γ单链抗体的构建[D];东北农业大学;2009年
9 李永锋;鹅和番鸭细小病毒VP3-ELISA诊断方法的建立[D];中国农业科学院;2010年
10 荆志强;鹅细小病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制[D];东北农业大学;2010年
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6 娄华,杨德威,贺东升,白挨泉,秦智锋,刘福安;番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断[J];中国预防兽医学报;2000年06期
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8 刘中勇;李福伟;曹宗喜;李惠敏;吴玄光;张桂红;;7株鹅细小病毒的克隆序列分析与分子特性[J];中国兽医杂志;2009年07期
9 余兵,王永坤,刘宝荣,朱国强,严维巍,王建业;鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析[J];病毒学报;2002年03期
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10 宋永峰;宋延华;温纳相;周丽;周全;高恒;管凤霞;黎敏;;番鸭源鹅细小病毒XX-08株VP2基因的克隆和序列分析[A];中国家禽科学研究进展——第十四次全国家禽科学学术讨论会论文集[C];2009年
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中国博士学位论文全文数据库 前7条
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2 李雪梅;鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达[D];中国人民解放军军需大学;2001年
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4 鲜思美;水禽重要疫病的多重PCR与基因芯片检测技术研究[D];四川农业大学;2009年
5 于天飞;鹅细小病毒非结构和结构蛋白B细胞线性抗原表位区的筛选[D];东北农业大学;2007年
6 杨金龙;小鹅瘟强毒在人工感染雏鹅体内侵染规律及对消化道菌群结构影响的分子解析[D];四川农业大学;2009年
7 赵丽荣;鹅细小病毒结构蛋白基因遗传进化分析及其基因免疫研究[D];东北农业大学;2006年
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1 刘大鹏;鸭源抗鹅细小病毒卵黄抗体的制备[D];东北农业大学;2011年
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3 马波;鹅细小病毒VP1基因的克隆、序列分析及表达载体的构建[D];东北农业大学;2002年
4 杜秋明;鹅细小病毒单克隆抗体的制备及单抗双夹心ELISA检测方法的建立[D];延边大学;2011年
5 黄诚;检测鹅细小病毒(GPV)强毒PCR方法的建立及人工感染GPV强毒在雏鹅体内分布规律的研究[D];四川农业大学;2003年
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7 李桂霞;鹅细小病毒中国分离株HG5/82的回顾性研究[D];新疆农业大学;2004年
8 李宝臣;鹅细小病毒VP3基因的克隆、序列比较及原核表达[D];东北农业大学;2003年
9 邢明伟;鹅细小病毒非结构蛋白NS2基因的克隆及原核表达[D];东北农业大学;2002年
10 赵丽荣;表达鹅细小病毒VP3基因重组禽痘病毒的构建[D];东北农业大学;2003年
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