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三七病毒病病原的初步研究

金羽  
【摘要】:三七是我国重要的传统大宗中药材,由于其对生长环境条件的特殊要求,现仅生长于中国西南山区。近年,三七病毒危害十分严重。 云南省文山州三七病毒病表现4种症状:叶脉皱缩黄化、叶片皱缩畸形、叶片褪绿黄化和叶片皱缩白绿花叶,将其编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4组,通过生物学、血清学及分子生物学方法对其病毒毒原进行初步鉴定。 通过机械摩擦方法接种鉴别寄主,得到4组三七样品在9种鉴别寄主上较一致的症状。其中德伯尼烟表现叶片褪绿变褐;朝天椒顶枯;双富大椒幼叶畸形:千日红叶片出现系统枯斑;洋酸浆心叶褪绿斑驳、植株矮化;昆诺阿藜、苋色藜接种叶产生局部枯斑。实验确定千日红、朝天椒为较好的鉴别寄主;德伯尼烟、朝天椒为较好的繁殖寄主。 ELISA分析显示表现皱缩白绿花叶的Ⅳ号样品与CMV(Cucumber mosaic virus)ELISA检测试剂呈弱阳性反应,4组三七病样及接种发病鉴别寄主德氏烟、朝天椒、曼陀罗、千日红均与POTY(Potyvirus)ELISA检测试剂有弱阳性反应。 将三七样品和接种发病鉴别寄主样品的病毒粗提纯液用负染法制片,在电镜下均观察到线状(700-830nm)和长线状(1370-1928nm)直径均约12nm的2种粒体。 通过分子生物学检测,表现皱缩白绿花叶的Ⅳ号样品用CMV特异引物扩增出目的条带,克隆其CP基因并测序,将其CP基因核苷酸序列与其他CMV属病毒的CP基因核苷酸序列进行比较,结果表明此序列与已发表的Cucumber mosaic virus50多种分离物的外壳蛋白相应区域基因序列同源性均为98%,CP基因部分共654个核苷酸,编码218个氨基酸,外壳蛋白分子量24kDa。这与血清学的检测结果一致。 以表现叶片褪绿黄化的Ⅲ号样品所提核酸为模板,用Potyvirus属RACE引物2次扩增后,共得到从3’端Poly(A)开始的3099bp的核苷酸序列,此时再利用第3对引物对序列继续扩增,预期位置没有条带出现。所得序列在GenBank中的BLAST结果与马铃薯Y病毒属的胡萝卜Y病毒(Carrot virus Y)、芹菜花叶病毒(Celery mosaic virus)、芹菜Y病毒(Apium virus Y)CP基因序列中420-500bD的核苷酸同源性达到80%;与菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus)多聚蛋白基因序列中编码NIb部分150左右核苷酸的同源性在85%左右。 综合几种鉴定方法结果表明三七病毒病存在复合侵染现象,表现皱缩白绿花叶症状的Ⅳ号样品中至少含有2种病毒分离物,其中有CMV,还有1种与马铃薯Y病毒属有血清学关系和部分核苷酸序列同源性的病毒,该结论在国内外首次报道。由于尚未得到该病毒分离物的基因组全序列,所以其分类地位有待于进一步研究明确。


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