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《东北农业大学》 2007年
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枯草杆菌224 yhdP、yugS、yhdT和yqhB基因敲除及对其溶血性的影响

刘杰  
【摘要】: 枯草芽孢杆菌224(Bacillus subtilis 224,BS224)是从人体中分离出来的一种非致病菌。它不但是用途广泛的工程菌株,而且具有抗菌消炎的作用,能够用于烧、烫伤的治疗。根据微生态学原理,利用微生物间的拮抗作用,由枯草芽孢杆菌BS224活菌体制成的生物制品抑菌生和白天鹅气雾剂都具有改善创面微生态环境、抗菌消炎和促进创面愈合的作用。然而,由于存在溶血性,使这两种药物在用于烧、烫伤的治疗时,对创面造成了一定程度的损害。因此,大大限制了这两种药物的使用。 自从枯草芽孢杆菌168基因组全碱基测序完成以后,有8个可能与溶血有关的基因被发现,分别为yqhB(1329bp),yrkA(1305bp),yugS(1305bp),yhdT(1386bp),yhdP(1335bp),yqxC(810bp),yplQ(642bp),ytjAα(228bp),其中前5个基因同源性很高,为69.83%,而),ytjAα为α溶血素样基因。溶血样基因的发现使得对枯草杆菌溶血性的研究(包括确定溶血基因和溶血发生的分子机理)成为可能。 本实验是根据枯草杆菌168基因组的序列设计引物,以枯草杆菌224的染色体DNA为模板,利用PCR技术扩增了yhdP、yugS、yhdT和yqhB 4个基因,并将它们分别插入克隆载体pMD18-T中,构建了重组质粒pMD18-T-yhdP、pMD18-T-yugS、pMD18-T-yhdT和pMD18-T-yqhB。连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态中,并从含IPTG和X-gal的青霉素抗性平板上筛选出阳性克隆。应用酶切的方法对阳性重组子进行了鉴定,最后对阳性重组子进行测序分析。结果表明克隆的这4个基因yhdP、yugS、yhdT和yqhB的核苷酸序列与Genbank上已发表的序列的同源性分别为99.9%、99.6%、99.9%和99.9%,因此可以确定枯草杆菌224的基因组含有这4个基因。 为了构建基因打靶载体的骨架质粒,根据载体pEGFP-N1基因全序列设计引物,并以pEGFP-N1质粒DNA为模板,通过高保真的Ex Taq酶扩增出含有自身启动子的新霉素抗性基因的DNA片段,并将其也连入克隆载体pMD18-T中,阳性重组质粒经酶切鉴定后进行测序分析。结果表明克隆的新霉素抗性基因的核苷酸与已发表序列完全一致,证明重组质粒pMD18-T-neo构建成功。 然后克隆打靶载体的长、短臂,在yhdP、yugS、yhdT、yqhB四个基因的同源短臂引物的5′端分别引入SalⅠ和PstⅠ酶切位点,在yhdP、yugS和yqhB三个基因的同源长臂引物的5′端上引入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,而yhdT基因的同源长臂引物的5′端引入KpnⅠ和XbaⅠ酶切位点,这样扩增出的目的片段连入pMD18-T simple载体,从获得的阳性重组质粒上切下目的片段将携带引入的酶切位点,以便于连入打靶载体。 选择两种不同的方法将长、短臂连入打靶载体。其一:首先将骨架质粒pMD18-T-neo用SalⅠ、PstⅠ分别单酶切,接着把用碱性磷酸酶CIAP处理过的骨架质粒与短臂连接,连接产物转化入大肠杆菌JM109扩培,然后按照类似的方法再连入前臂,这样就构建好了打靶载体。yhdP基因的打靶载体就是通过这种方式构建的;其二:将骨架质粒pMD18-T-neo用KpnⅠ和PstⅠ双酶切,回收大片段pMD18-T,然后再用BamHⅠ(XbaⅠ)和SalⅠ双酶切小片段neo~r基因,最后将这两个片段与长、短臂用T4DNA连接酶连接,这样就构建好了打靶载体。yugS、yhdT和yqhB的打靶载体就是通过第二种连接方法构建的。 将构建好的基因打靶载体用KpnⅠ和PstⅠ双酶切线性化后,电转化入枯草杆菌224中,新霉素抗性平板筛选。抗性转化子利用PCR鉴定方法筛选yhdP、yugS、yhdT和yqhB基因缺失株。鉴定yhdP基因缺失株时,利用在前臂的上游序列和后臂的下游序列设计引物进行PCR检测:而鉴定yugS、yhdT和yqhB基因缺失株时,是利用在新霉素抗性基因的下游和同源后臂的外侧设计引物进行PCR检测。对yhdP、yugS、yhdT和yqhB分别检测96、163、105和87个抗性转化子检测出1株基因缺失株。 将yqhB,yugS,yhdT,yhdP四个基因缺失株接种到5%的绵羊血琼脂平板上进行溶血性检测,结果这四个基因缺失株在血平板上仍能够引起溶血,这说明单独敲除枯草芽孢杆菌224上染色体的4个基因yhdP、yugS、yhdT和yqhB的任何一个基因并不影响菌株的溶血。 本实验在枯草杆菌168完成全序列分析之后,首次对枯草杆菌224的溶血样进行克隆,而且利用同源重组的方法构建yhdP、yugS、yhdT和yqhB基因缺失株并进行溶血性检测以确定溶血基因或引起溶血的主效基因,探讨溶血作用发生的分子机理,最后改造BS224使其在医学方面得到更广泛的应用。同时也为枯草杆菌基因组中未知功能基因的的研究提供了一套行之有效的方法,为今后开展枯草杆菌蛋白组研究迈出重要一步。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q789

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【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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