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《东北农业大学》 2007年
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里氏木霉纤维素酶基因的克隆及其在毕赤酵母中表达的研究

徐天鹏  
【摘要】: 纤维素占植物干重的35%~50%,它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人类而言,它同时又是自然界中数量最大的可再生性物质,它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。 纤维素酶是一类可有效降解纤维素的生物酶,它一方面可将纤维素水解成葡萄糖等有效成分,另一方面它可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物(蛋白质、脂肪、淀粉)的提取率,所以纤维素酶可应用于以植物为原料的一切工业中。但天然的微生物生产纤维素酶还存在许多问题,如:酶产量低、酶活性低、受到葡萄糖等产物的反馈抑制等,这些问题极大的影响了纤维素酶的应用。而且尽管人们普遍接受纤维素酶分解纤维素的协同作用理论,但是对于作用机理还有许多问题需要研究。 甲醇酵母表达系统是近十几年发展起来的真核表达体系。巴斯德毕赤酵母作为甲醇酵母的一种,与传统的大肠杆菌表达系统及第一代酵母表达系统一酿酒酵母相比具有不可比拟的优势。它具有表达外源基因的能力强、稳定性高、可进行蛋白质的翻译后加工、既可在胞内表达也可分泌表达、可高密度发酵培养等诸多优点,尤其适合表达真核生物的基因,已成为一种非常重要的表达系统。 本研究以里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414菌株为基因供体,克隆纤维素酶多酶体系中的葡聚糖内切酶(EG)、葡聚糖外切酶(CBH)和β-葡萄糖苷酶(BG)基因,分别构建其酵母表达载体,并通过电击转化到毕赤酵母中,诱导其表达纤维素酶,筛选出高效表达纤维素酶基因的工程菌,为进一步研究纤维素酶的协同作用和分子酶工程奠定基础。 主要研究结果如下: 以羧甲基纤维素钠为诱导剂诱导里氏木霉表达纤维素酶,确定了最佳诱导时间为36小时。 采用RT-PCR方法克隆到了纤维素酶多酶体系中的葡聚糖内切酶(EGⅡ、EGⅣ、EGⅤ)和葡聚糖外切酶(CBHⅡ)。测序得到CBHⅡ基因的序列与GeneBank上编号为M16190.1的CBHⅡ基因序列有3个碱基不同,相似性达到99%,导致其编码的蛋白序列有3个氨基酸的差异;EGⅡ基因的序列与GeneBank上编号为M19373.1的EGⅡ基因序列有5个碱基不同,相似性达到99%,导致其编码的蛋白序列有2个氨基酸的差异:EGⅤ基因的序列与GeneBank上编号为Z33381.1的EGⅤ基因序列有2个碱基不同,相似性达到99%,导致其编码的蛋白序列有2个氨基酸的差异。 采用外显子拼接法,以里氏木霉DNA为模板克隆了β-葡萄糖苷酶(BGLⅠ)基因。测序得到BGLⅠ基因的序列与GeneBank上编号为U09580.1的BGLⅠ基因序列有4个碱基不同,相似性达到99%,导致其编码的蛋白序列有3个氨基酸的差异。 构建了CBHⅡ基因的酵母表达载体pPIC9-CBH,用BglⅡ单酶切使载体线性化。回收后通过电击转化到毕赤酵母中,得到了3个转化子,经PCR鉴定获得2个转化CBHⅡ基因的重组毕赤酵母。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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3 姚继明;张双利;;退浆酶退浆改善黑牛仔服装的酶洗效果[A];“亚伯”杯2011年第五届全国纺织印染助剂学术交流会论文集[C];2011年
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7 王景会;姜媛媛;李玉秋;李达;杨贞耐;;微小毛霉凝乳酶基因的克隆及在毕赤酵母中的重组表达[A];首届中国奶业大会论文集(下册)[C];2010年
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9 井长伟;;嗜热毛壳菌纤维素酶对肉免生长性能的影响[A];2007山东饲料科学技术交流大会论文集[C];2007年
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1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 张婕;嗜热真菌热稳定几丁质酶基因的克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
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5 蔡维嘉;利用毕赤酵母系统的丙型肝炎病毒重组E1E2糖蛋白的表达、纯化和性质研究[D];武汉大学;2010年
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8 咸洪泉;菌寄生真菌几丁质酶基因的克隆及功能研究[D];山东农业大学;2011年
9 王秀娟;嗜热真菌纤维二糖水解酶(CBHⅠ、CBHⅡ)和内切葡聚糖酶(EGⅠ)的分子改造[D];山东农业大学;2011年
10 张丽青;嗜热毛壳菌超氧化物歧化酶基因的克隆、表达及转基因烟草耐盐性研究[D];山东农业大学;2011年
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1 于宾宾;表达猪β-防御素-2成熟肽重组酵母工程菌的构建[D];华中农业大学;2010年
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3 吴关威;香菇柄中滋味成分释放研究及香菇精的研制[D];华中农业大学;2010年
4 董俊丽;深海细菌Martelella mediterranea纤维素酶基因的克隆、表达与酶学分析[D];华中农业大学;2010年
5 谢久凤;亮斑扁角水虻(Hermetia illucens L.)幼虫肠道内纤维素酶活性菌株的筛选与鉴定[D];华中农业大学;2010年
6 潘海波;利用DNA体外重组技术构建高活性纤维素酶基因工程菌[D];安徽工程大学;2010年
7 王美花;里氏木霉swollenin在米曲霉中的表达和纯化[D];浙江理工大学;2010年
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9 王志强;内切葡聚糖酶基因的克隆及其在毕赤酵母GS115中的表达[D];郑州大学;2010年
10 郭晓红;嗜热毛壳菌热稳定脂肪酶的基因克隆、表达及性质研究[D];山东农业大学;2010年
【同被引文献】
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3 王嘉渊;周斐红;陈捷;;玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1和Clm1基因的克隆与功能分析[A];公共植保与绿色防控[C];2010年
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2 李亚玲;嗜热真菌热稳定纤维素酶的分离纯化及基因的克隆与表达[D];山东农业大学;2007年
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4 张亚波;嗜热真菌热稳定纤维素酶的分子改造[D];山东农业大学;2009年
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
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