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亚麻离体再生及早期体细胞胚胎发生机理的研究

王克臣  
【摘要】: 亚麻(Linum usitatissimum L.)是一种重要的经济作物,亚麻茎杆可以剥取高档纤维用于纺织业,籽粒可以榨制富含高不饱和脂肪酸的营养保健油品。黑龙江省是我国纤维亚麻的主要产区,随着人们生活水平的提高,发展亚麻生产显得越来越重要。本文选择特点各异的国产品种黑亚14和引进品种Opaline为代表,对纤维亚麻在器官发生和体细胞胚胎发生过程中的组织细胞学、生理生化特性、内源激素含量变化、RAPD标记进行了研究,以阐述其发生机理。研究结果如下: 1.对亚麻器官发生途径的培养条件进行了优化,试验得出了不同基因型无菌苗的最佳消毒时间,10-15日龄的无菌苗活性较好,亚麻下胚轴是诱导愈伤组织最理想的取材部位,平放外植体对出愈最有利。器官发生途径的初始愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+4mg/L IAA +2mg/L KT;诱导不定芽发生的最佳培养基为B5+2.5mg/L KT +1mg/L IAA;出苗后最佳生根诱导培养基为1/2B5+0.3mg/L IBA。初始愈伤组织诱导周期为20d左右,呈淡绿色,质地致密坚硬。不定芽诱导周期为30d,IAA与KT是诱导亚麻愈伤组织出芽的关键物质。本实验中基因型间生长趋势差异明显,添加1.5g/L的活性炭可降低愈伤组织褐化率。 2.以体胚发生为目的的亚麻初始愈伤组织的诱导,需要高浓度的2,4-D和较低浓度6-BA,但是过高浓度的2,4-D会抑制出愈和愈伤组织的生长,最佳诱导培养基为MS+2mg/L 2,4-D +0.5mg/L 6-BA;体细胞胚胎诱导培养基为MS+0.5mg/L NAA +0.5mg/L 6-BA;胚性愈伤组织大多呈黄白色,小颗粒状、松散易剥离,表面湿润。基因型对体胚发生影响明显,本实验只在H14体胚诱导中得到了球形胚和心形胚。另外光的变化对亚麻体胚发生没有影响。 3.组织细胞学研究表明,亚麻胚性愈伤组织细胞规则,细胞核大,细胞质浓,非胚性愈伤组织细胞体积大,细胞核小,细胞质稀薄。体细胞胚发生经历了胚性细胞团、2细胞、3细胞、多细胞原胚、球形胚、心形胚发育阶段,但是没有更远的发展。PAS反应中,H14外植体下胚轴的横切可见到皮层内侧有淀粉粒分布,OP外植体子叶的横切可观察到栅栏组织细胞有淀粉粒分布;H14和OP初始愈伤组织外缘淀粉粒较多。H14和OP胚性愈伤组织胚性细胞含有大量的淀粉粒,与细胞的进一步分裂和分化提供能量有关。 4.透射电镜观察表明,初始愈伤组织细胞有非常明显的中央大液泡,细胞质被中央大液泡挤压成一薄层分布于细胞的边缘,细胞核被大液泡挤压,位于细胞的一角,但仍可观察到核仁的存在。胚性愈伤组织细胞壁与初始愈伤组织细胞壁相比加厚,细胞质浓厚,充满整个细胞,细胞核大,核仁明显,在靠近细胞膜的胞质区域里有较多的淀粉粒,还可观察到其内含有淀粉粒的叶绿体。非胚性愈伤组织细胞几乎完全为中央大液泡所占据,细胞质被挤压在四周,很难观察到细胞核和其它细胞器。褐化组织细胞器崩解基本没有细胞器。扫描电镜观察表明,亚麻初始愈伤组织表面较质密,细胞之间排列紧密,没有空隙;胚性愈伤组织表面较光滑,细胞形成团粒结构,形成团粒的细胞之间结合紧密,团粒与团粒之间结合松散,可观察到大的空隙,细胞形状较规则。非胚性和褐化愈伤组织表面形状不规则,有较多的覆盖物,呈片状,细胞形状不规则,体积较大。 5.在胚性愈伤中的CAT、POD、可溶性蛋白、核酸和可溶性糖含量均高于非胚性愈伤组织,这些物质含量和组分的变化可能与胚性的维持和细胞的旺盛分裂分化有关。CAT、可溶性糖在无菌苗含量最高,CAT、核酸、可溶性蛋白、可溶性糖在褐化组织中最低,可以说明褐化愈伤组织的生理状态。POD在初始愈伤中含量最高,这与机械性损伤有关;SOD在无菌苗和不定芽期含量高,初始愈伤组织中的含量是最低的,与其抗氧化能力密切相关;可溶性糖等指标在原胚和球形胚时期均呈上升趋势,为体胚发生作好物质和能量上的准备。 6.SDS-PAGE结果显示,非胚性愈伤组织蛋白染色非常浅,蛋白代谢非常弱。亚麻体胚发生各时期的主要蛋白质组分相似,体现了体胚蛋白质组分的稳定性。H14各个阶段的蛋白质范围约为24-94kD,OP各个阶段的蛋白质范围约为20-100kD。在亚麻体细胞胚胎发生早期,共出现了9条POD同工酶酶带,其中有6条带是在亚麻体胚发生早期各阶段陆续出现的,可以作为体细胞胚发生的生化标记。淀粉同工酶在亚麻体胚发生早期出现的条带很少,酶带在非胚性和褐化组织中较多,而且淀粉同工酶的条带数也因品种不同而不同。亚麻早期体胚发生过程中,各个阶段EST同工酶酶带颜色由深到浅,这与POD同工酶酶带颜色和淀粉同工酶酶带颜色的变化相反。 7.内源激素水平和激素间的平衡对亚麻形态建成具有重要的调节作用。胚性愈伤组织中的IAA含量高于非胚性愈伤组织,而且在原胚期和球形胚时期都保持了较高的水平,褐化组织中的IAA含量最低。ABA在外植体中的含量最高,在原胚和球形胚时期较低,低含量水平的ABA有利于胚的形成。ZR的峰值出现在初始愈伤中,胚性愈伤中的ZR含量低于非胚性愈伤。胚性愈伤中的IAA/ZR远高于非胚性愈伤,这可能有利于胚性能力的表达。 8.本实验中,亚麻染色体数2n=32,继代5次以后变异率为2.5%,继代9次后变异率为4.3%,既有数量变异,也观察到有染色体结构的变异。经RAPD标记,发现引物S10、S21、S24和S48扩增产物的电泳结果中,褐化组织比无菌苗及其它时期少一条带,说明在继代过程中(到褐化组织时),亚麻的基因组DNA发生了变异。


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