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《东北农业大学》 2008年
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两种来源乳杆菌的分离鉴定及遗传多态性研究

张杨  
【摘要】: 乳杆菌属(Lactobacillus)是乳酸菌中最大的一个属,也是乳酸菌中对食品工业最为重要、最常见和应用最广泛的一个属。作为益生菌,乳杆菌以其优良的益生作用而受到广泛的关注。我国蔬菜资源丰富,酸菜作为一种传统的乳酸发酵蔬菜制品,其汁液中富含乳酸菌活菌,其中尤以短乳杆菌和植物乳杆菌占优势。另外,乳酸菌也是猪消化道前段的优势菌群,自然存在于猪肠道正常菌群的乳酸杆菌有:嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌,其中最主要的是嗜酸乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。 乳杆菌的传统鉴定方法主要是依赖乳杆菌的表型特征,尽管这些方法依然是目前鉴定乳杆菌的主要方法,但更多的研究显示,对乳杆菌准确分类还需要进行基因水平上的鉴定。单纯的依靠表型特征试验易造成乳杆菌鉴定结果不准确,故必须结合分子生物学鉴定结果才能对乳杆菌进行准确鉴定。本研究的主要研究内容为分离植物源和动物源的乳杆菌,并对其进行鉴定和遗传多态性分析。 本研究主要取得如下研究结果: 1.乳杆菌的分离纯化及菌种保存 以自然发酵的优良东北酸菜和猪肠道内容物为样品,以改良MRS培养基为分离培养基,厌氧条件培养,对这两种来源的乳杆菌进行分离、纯化以及菌株保藏。并通过形态学特征和过氧化氢酶试验,初步确定从酸菜样品和猪肠道样品中分别分离得到乳杆菌39株和29株。 2.乳杆菌的生理生化鉴定 通过明胶液化试验、吲哚试验、H_2S产生试验、硝酸盐还原试验进一步验证所分离的菌株,结果显示从酸菜样品和猪肠道样品分离得到的菌株中分别有34和25株属于乳杆菌属:对分离自酸菜的L1~L10株,以及分离自猪肠道的L10~L20株进行糖发酵实验,通过它们对单糖、二糖、多糖以及糖苷和糖醇类等碳水化合物的利用情况初步确定其种。 3.利用16S rDNA的序列聚类分析鉴定乳杆菌 使用一对乳酸菌特异性引物扩增分离株L1~L20的16S rDNA序列,得到大小为1500bp左右的16S rDNA片段,然后进行测序。将分离株的测序结果与参比菌株的序列进行比对,得出他们之间的相似百分比,同时结合糖发酵结果确定这20株菌为:干酪乳杆菌1株、短乳杆菌4株、棒状乳杆菌1株、植物乳杆菌3株和米酒乳杆菌1株:罗伊氏乳杆菌4株、约氏乳杆菌2株、嗜酸乳杆菌2株、发酵乳杆菌1株、唾液乳杆菌1株。 4.利用PCR-RFLP技术研究乳杆菌的遗传多态性 用3种限制性内切酶XbaⅠ、MspⅠ和AluⅠ分别消化分离株L1~L20的16S rDNA,其中MspⅠ酶和AluⅠ酶产生丰富的酶切图谱,将L1~L20分成了10个遗传型,表明分离株具有遗传多态性特征。 5.利用PCR-DGGE技术区分不同种的乳杆菌 使用一对乳酸菌的特异性引物扩增L1~L20的V7~V8高可变区,变性梯度凝胶电泳的结果证明这种方法能够区分不同种的分离株,其结果与传统方法以及16s rDNA的序列聚类分析的结果相一致。 本研究从两种来源样品中分离得到59株乳杆菌,并将其中的20株分离菌株鉴定到种水平,为进一步研究和应用奠定了基础:另外还分析了几种分子生物学方法在乳杆菌鉴定和区分中的作用,为以后系统化鉴定乳杆菌提供了依据。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:TS201

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【引证文献】
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