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《东北农业大学》 2009年
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产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析

李晓静  
【摘要】: 产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是创伤性气性坏疽和人类食物中毒以及动物坏死性肠炎、肠毒血症的主要病原菌之一。其致病因子是菌体分泌的外毒素,根据产生外毒素的种类不同,可分为A、B、C、D和E5个血清型,其中α毒素(C.perfringens alpha toxin,CPA)是各型产气荚膜梭菌产生的共同毒力因子,也是A型菌产生的最主要毒素,其能破坏细胞膜的完整性,导致细胞裂解,从而具有细胞毒性、溶血性、致死性和皮肤坏死性等特性。疾病发生是肠道内细菌大量繁殖产生毒素,经消化道吸收发生的毒素中毒性疾病。 针对本病肠道吸收毒素和细菌在肠道大量繁殖特点,设计以有效刺激肠道黏膜免疫系统,以阻断疾病因子入侵机体的第一道防线进行免疫预防对科学防治本病具有重要意义。本研究以干酪乳杆菌Lactobacillus casei ATCC 393(L.casei 393)作为递呈抗原的活菌载体,利用α毒素位点突变的基因片段(从核苷酸水平上将编码第68位组氨酸残基突变成甘氨酸残基,使其毒性丧失,仍保持完整抗原性)插入到乳酸杆菌载体,构建了表面表达和分泌表达产气荚膜梭菌α毒素的重组乳酸杆菌系统。以此作为口服制剂,通过乳酸杆菌表达和传递外源抗原和乳酸杆菌本身的肠道黏附性特性、耐胆汁酸盐、耐胰酶和对肠道的定植和益生作用,有效刺激机体肠道黏膜免疫系统,达到免疫防治产气荚膜梭菌毒素中毒的目的。 以含有编码产气荚膜梭菌α毒素蛋白基因的PEG-30b-α质粒为模板,根据表达载体融合表达位点及干酪乳杆菌密码子使用的偏爱性,应用oligo6.0软件设计一对引物,经PCR扩增出约924bp的目的基因,将该基因片段克隆到pMD18-T simple载体,并进行了酶切、PCR鉴定,重组质粒命名为pMD18-T-α。重组质粒经SphⅠ和XhoI双酶切,回收目的基因片段,分别与经同样双酶切的表达载体pPG-1和pPG-2连接,电转化感受态L.casei 393,筛选阳性克隆,并进行酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒命名为pPG-1-α和pPG-2-α,重组干酪乳杆菌命名为pPG-1-α/L.casei393和pPG-2-α/L.casei393。 将获得的两种重组干酪乳杆菌以1%乳糖为诱导剂进行目的蛋白的诱导表达。细胞表面表达型及分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后的SDS-PAGE检测结果表明,有约34kD的融合蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析表明,表达的蛋白可被兔A型产气荚膜梭菌α毒素抗血清所识别,间接免疫荧光及Western blot实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到;分泌表达型重组干酪乳杆菌经诱导后,对诱导表达的菌体及培养上清液进行SDS-PAGE检测表明,有约34kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western blot结果分析所表达的蛋白具有与天然毒素蛋白一样的抗原特异性。 为探讨产气荚膜梭菌α毒素蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为活菌疫苗潜在的应用价值,本实验以BALB/c小鼠为试验动物,进行免疫学实验。免疫程序为:实验鼠口服接种109活菌量,每隔2w免疫一次,共免疫四次,每次连续免疫3d,一天免疫一次。同时,以口服空载体干酪乳杆菌及PBS为阴性对照。免疫后分别测定了小鼠粪便、阴道粘液、泪液样品中抗α毒素分泌型IgA及小鼠血清样本中抗α毒素的特异性IgG水平。ELISA检测结果表明,口服免疫重组干酪乳杆菌后在小鼠粪便、阴道粘液、泪液样品中均检测到了特异性sIgA。同时在小鼠血清中亦检测到了较高水平的血清抗体,说明构建的重组干酪乳杆菌表达系统可诱导局部免疫应答,又可刺激机体产生系统的体液免疫应答。此外,对第四次免疫十天的小鼠进行α毒素攻毒实验,以探讨重组干酪乳杆菌所产生的α毒素抗体对鼠的保护作用,鼠攻毒试验结果亦证实表达α毒素干酪乳杆菌系统免疫鼠后产生的α毒素抗体能够抑制A型产气荚膜梭菌分泌天然α毒素对鼠的攻击。收集免疫后鼠血清做α毒素中和实验,也证明了血清有中和α毒素的能力。分析了两种表达方式的重组干酪乳杆菌的免疫效果,结果表明分泌型的重组菌免疫性更好,为以活菌作为载体进行口服疫苗研制方面其抗原物质的最佳提呈方式提供了依据。 本研究首次构建了重组产气荚膜梭菌α毒素蛋白的干酪乳杆菌细胞表面表达和分泌表达系统,表达产物免疫动物后产生的抗体,具有良好的免疫保护作用,实验结果充分说明所构建的重组干酪乳杆菌表达系统作为口服疫苗具有潜在的应用价值。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S852.61

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【引证文献】
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【参考文献】
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【共引文献】
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【同被引文献】
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