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《东北农业大学》 2009年
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苏云金芽胞杆菌新cry基因克隆、表达与杀虫功能研究

刘楠  
【摘要】: 农业害虫的防治,一直以来都是我国农业面临的主要问题,大量施用化学农药是害虫防治最主要的解决方案。但化学农药的滥用,已经对人类健康和环境造成了巨大危害,同时引起了害虫抗药性产生的严重后果,使得田间用药量进一步增加,防治成本不断加大,污染进一步加重。生物防治是解决这些问题的有效途径之一。在过去的60年中,因对环境和人畜安全、无残留,苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt),作为一种优秀的生物杀虫剂,在农业害虫防治中扮演了重要的角色,已经发展成为全球产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。 Bt是一种可以形成芽胞的革兰氏阳性菌,其伴孢晶体蛋白对多种属的昆虫有毒杀作用。由于不同的Bt蛋白对不同的农业害虫有着不同的生物活性,其杀虫谱专一,这就迫切要求发现新的基因和发掘已知基因的新的活性。 首先利用PCR-RFLP鉴定Bt菌株S6,发现可能存在有cry1A、cry1E、cry1K、等基因型设计cry1Ah全长引物以菌株S6质粒为模板,克隆了cry1Ax基因全长,并在大肠杆菌中进行了表达。对Cry1Ax蛋白进行了生物活性测定,测定对象为小菜蛾Plutella. xylostella (Linnaeus)和亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)。均具有高毒力LC50分别为0.6990μg ml-1,5.0939μg g-1。对敏感棉铃虫有显著的体重抑制作用LWC50为17.4908μg ml-1。 利用两种苏云金芽胞杆菌原毒素Cry1Ba3、Cry1Ia8及其组合,分别对Cry1Ac抗性种群小菜蛾幼虫进行生物活性测定。结果表明Cry1Ba3、Cry1Ia8对两种目标试虫均有高毒力,LC50分别为0.2175、0.6706μg /mL;Cry1Ba3毒力3倍于Cry1Ia8。两种蛋白混配的结果也表现出高毒力,LC50为0.4375μg/mL,没有显著的协同增效作用,也不存在拮抗。敏感与抗性小菜蛾种群生测结果统计分析比较,结果表明这两种蛋白及其组合与Cry1Ac并无交互抗性。 对运用PCR-RFLP无法鉴定的菌株SC7-D1,运用PCR两步法,克隆出一段基因片段,全长1414bp,翻译成氨基酸的比对结果显示,存在cry类基因的典型的三个结构域,或其片段。并与Cry8Ka2相似性最高,为46%,可能是一个新的模式基因的片段。 利用本实验室多种的Bt蛋白对杨扇舟蛾和舞毒蛾两种危害严重的林业害虫进行了初筛。舞毒蛾:Cry2Ab 0.39ppm死亡率16.7%,1.563ppm死亡率为20%,Cry1Ah 1.563ppm时死亡率最高为60%,Cry1Ba 25ppm死亡率最高56.7%,Cry2Ad 0.39ppm的死亡率为43.3%。 杨扇舟蛾:浓度为100ppm时,Cry1Ia、Cry2Ab、Cry1Ah、的死亡率为20%,40%,80%。纯化了蛋白Cry2Ab4,并用切胶的方法制备了Cry2Ab4的抗体,为研究Cry2Ab4的杀虫机理奠定了基础。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S476.1

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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