收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

苏云金芽胞杆菌的筛选鉴定及新型cry基因克隆、表达的研究

周长梅  
【摘要】: 苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)作为一种高效、安全、无污染的昆虫病原微生物,在害虫的生物防治中得到了广泛的应用,已发展成为全球产量最大、应用面积最广的微生物杀虫剂。因此,对Bt的研究越来越受到世界各国的重视,对Bt资源的调查也在逐渐扩大。我国地域辽阔,生态环境复杂多样,深入发掘我国丰富的苏云金芽胞杆菌资源,筛选高毒力菌株、分离克隆新的高效广谱杀虫基因,对构建高效广谱工程菌及培育转基因抗虫植物具有深远意义。 本研究对黑龙江省不同类型土壤采集的土样及四川省5个地区采集的土样进行了苏云金芽胞杆菌的分离、鉴定,并进行了新型cry基因的克隆和表达研究。结果如下: 1.从黑龙江省不同类型土壤中采集372份土样,共分离出Bt菌株41株,出菌率为11.02%。黑土与暗棕壤Bt出菌率较高,分别为15.53%及13.95%,黄沙土出菌率最低仅为5.88%,在采集的17份盐碱土中未分离出Bt菌,说明Bt分布的丰度与土壤类型有很大关系。采用PCR-RFLP方法,对41株菌株进行了基因型鉴定。结果表明:32株含有cry1型基因(其中有两株菌株的酶切图谱中含有新的特异性条带,推测含有新的未知基因),13株含有cry2型基因,12株含有crylI型基因,另有9株菌株未鉴定出已知基因。 2.从四川省采集的207份土样中,共分离出26株Bt野生菌株,平均出菌率为12.56%。26株Bt分离株伴胞晶体的形态有球形、方形、菱形、及不规则形,且多数菌株都同时含有多种形态的伴胞晶体,充分体现了四川省Bt菌株资源的多样性。基因型的鉴定结果也可看出四川生态条件下Bt菌株多样性的特点,26株菌株共含有cryl、cry2、cry1I及cry9四种基因型,其中21株含有cry1型基因,8株含有crylI型基因,11株含有cry2型基因,13株含有cry9型基因,5株菌株未鉴定出已知基因。多数菌株都同时含有多种类型的基因组合,以crylAa、cry1Ac、crylIb、cry2Ab、cry9Ba基因型最丰富。 3.对两省分离的67株Bt菌的SDS-PAGE分析表明:多数菌株表达了130kD的蛋白,少数菌株表达了60、120和140kD的蛋白,在个别菌株中还发现有45kD、70kD和90kD的蛋白表达,可以推测,在这些菌株中可能含有新型的杀虫基因,另有2株菌株未发现有任何蛋白表达,其原因有待于进一步研究。 4.系统地研究了Bt菌株BF-4和NJ-1的生物学特性。BF-4的10项生理生化反应结果与标准菌株猝倒亚种反应一致,NJ-1与蜡螟亚种一致;BF-4主要形成菱形、方形、球形晶体,NJ-1则形成菱形、球形和不规则形晶体;两株菌都表达140kD的蛋白,BF-4还同时表达了60kD的蛋白;BF-4含有3个大小不同的质粒,含有crylAa、cry1Ac、cry1Ib、cry2Ab和cry9Ba5种基因;菌株NJ-1含有2个大小不同的质粒,含有crylAa、cry1Ia和cry9Ba共3种基因。两株菌株的基因均定位于大质粒上。 5.从菌株BF-4中克隆了cry2Ab和cryllb两种基因。基因的核苷酸序列已经在GenBank中注册,Accession number分别为HM037126和HM051227,并经国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会分别正式命名为cry2Ab15和cryllb4o cry2Abl5的编码区为1905bps,编码634个氨基酸的蛋白,蛋白分子量为70.8kDa; cryllb4的编码区为2160bps,编码的蛋白质由719个氨基酸组成,该蛋白质的分子量为81.2kDa,等电点为6.71,为弱酸性蛋白质。序列分析结果表明cry2Ab15和cryllb4与已发表的基因在氨基酸序列上均有不同程度的差异,属于新的cry基因。 6.从菌株NJ-1中克隆了cry9Ba2。该基因的编码框由3495bp组成,所编码的蛋白质由1164个氨基酸组成,分子量为131.6kDa,pI=4.92,为弱酸性蛋白质。该基因序列与已报道的cry9Bal同源性最高达98%,该基因已在GenBank中注册,Accession number为GU299522,并经国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry9Ba2。 7. cry2Abl5和cryllb4均在大肠杆菌中获得了高效表达,cry2Ab15的表达产物对小菜蛾和棉铃虫均有很高的杀虫活性,3d的校正死亡率分别为100%和90.8%;Cry1Ib4对小菜蛾具有较好的活性,对大猿叶虫的毒力一般,96h的校正死亡率分别为82.5%和46.6%。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 蔡启良,刘子铎,喻子牛;苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年05期
2 刘晶晶;束长龙;张杰;宋福平;黄大昉;;苏云金芽胞杆菌内生质粒提取方法的改进[J];生物技术通报;2008年06期
3 李建洪,万秋英,王沫,姜锡权,喻子牛;苏云金芽胞杆菌新菌株的研究[J];湖南农业大学学报;2000年05期
4 蔡启良,刘子铎,喻子牛;苏云金芽胞杆菌生物活性成分研究进展[J];应用与环境生物学报;2003年02期
5 ;基因诱变、重组、克隆[J];生物技术通报;1993年08期
6 姚宝安,钟勤,王乾兰,赵俊龙,马丽华,喻子牛;对捻转血矛线虫幼虫有杀灭作用的苏云金芽胞杆菌的筛选[J];华中农业大学学报;1995年02期
7 沙莉;苏争先;黄小红;邱君志;关雄;;微生物几丁质酶的分子生物学研究及其应用[J];农业生物技术学报;2003年06期
8 王静敏,魏峰,张西臣,蔡亚男,刘全,吴涛,李建华,尹继刚;柔嫩艾美耳球虫杂交株MIC2基因克隆及序列分析[J];吉林农业大学学报;2005年04期
9 许崇波,王玉炯,许崇利;C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因的克隆与表达[J];生物技术;2005年05期
10 陈吉祥,杨慧,颜显辉,钟英斌,张晓华,李筠;致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测[J];中国水产科学;2005年05期
11 陈选阳;林世强;袁照年;张招娟;郑金贵;;甘薯zds基因的克隆与植物表达载体构建[J];福建农林大学学报(自然科学版);2005年04期
12 李落叶;井金学;;稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆[J];中国农学通报;2006年01期
13 杜金友;孟宪强;徐兴友;王同坤;郭学民;;植物耐盐相关基因克隆与基因工程的研究进展(综述)[J];河北科技师范学院学报;2006年01期
14 崔昌华;吴伟怀;郑肖兰;;植物病原镰刀菌属突变技术及相关基因研究进展[J];华南热带农业大学学报;2006年01期
15 谭小军;黄志平;李蔍芸;聂东宋;钟锠高;傅俊江;卢光琇;;一个人类精子发生相关新基因TSARG7的克隆和初步功能研究(英文)[J];遗传学报;2006年04期
16 郝春燕;李建国;李雅轩;晏月明;;小麦醇溶蛋白基因克隆研究进展[J];首都师范大学学报(自然科学版);2006年02期
17 王燕;汪以真;;猪激素敏感脂酶基因克隆与序列分析[J];中国兽药杂志;2006年05期
18 余贤美;李锐;郑服丛;;水稻CO39β-l,3-葡聚糖酶基因的克隆[J];热带作物学报;2006年02期
19 章振华;周雪媚;谌南辉;陈小玲;罗长保;李永清;;鸡补体分子C3d的基因克隆及结构分析[J];生物技术通讯;2006年04期
20 宋凯;宋继梅;张涌;;小鼠Oct4基因的克隆及其原核表达载体的构建[J];西北农业学报;2006年05期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 喻子牛;孙明;刘子铎;戴经元;陈亚华;;苏云金芽胞杆菌Cry基因命名十年的进展[A];全国生物防治学术讨论会论文摘要集[C];1995年
2 王建华;吴建平;费春红;杨联;张利平;;牦牛钙激活蛋白酶抑制蛋白CAST基因克隆及其测序分析[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
3 孙玲;余少波;刘榜;;猪Nudt6基因克隆以及与眼肌面积性状相关SNP发现[A];第十二次全国畜禽遗传标记研讨会论文集[C];2010年
4 戴佳琳;吴璇;黄江;杜武英;胡旭初;徐劲;余新炳;;亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4基因的克隆、表达及免疫反应性鉴定[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2008年
5 朱炎平;邱君志;关雄;;粉虱座壳孢(Aschersonia aleyrodis)几丁质酶基因克隆的研究[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年
6 吕海鹏;史俊南;赵守亮;Athony J.Smith;;人成牙本质细胞样细胞L型钙离子通道α_1亚基D亚型特异性基因的表达、纯化和多克隆抗体的制备[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
7 王玮;杜艳;林国强;孙秉中;;RNA干涉bcr abl融合基因联合P27基因克隆对K562细胞的影响[A];第12届全国实验血液学会议论文摘要[C];2009年
8 方卫国;肖月华;冷波;杨星勇;张永军;裴炎;;一种新的球孢白僵菌几丁酶Bbchit1的纯化和基因克隆[A];首届中国青年学者微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2002年
9 张志春;张谷丰;罗光华;方继朝;;小菜蛾嗅觉膜原蛋白SNMP1基因的克隆表达[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
10 王翠;李世军;李闯;俸艳萍;彭秀丽;龚炎长;;鸭多巴胺受体1(DRD1)基因克隆与多态性检测[A];安全优质的家禽生产——第十五次全国家禽学术讨论会论文集[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周长梅;苏云金芽胞杆菌的筛选鉴定及新型cry基因克隆、表达的研究[D];东北农业大学;2010年
2 李志勇;调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的CaM基因的克隆与功能分析[D];河北农业大学;2008年
3 谢科;水稻WRKY10基因的功能研究[D];浙江大学;2005年
4 邢继红;拟南芥抗灰葡萄孢相关基因的克隆和功能分析[D];河北农业大学;2006年
5 魏继承;白桦花期抑制性消减文库的构建及花发育相关基因的克隆[D];东北林业大学;2006年
6 赵明莲;食线虫真菌侵染性胞外蛋白酶的基因克隆与表达[D];云南大学;2003年
7 郭虹;弓形虫侵入相关分子ROP1基因的克隆及其DNA免疫研究[D];中山医科大学;1999年
8 王昕;巨噬细胞集落刺激因子可溶性受体的克隆表达及其相关性研究[D];中国协和医科大学;1998年
9 李伟;圆锥小麦地方品种遗传多样性研究[D];四川农业大学;2006年
10 段冷昕;梅花鹿茸多肽的化学结构及其抗肝纤维化作用[D];吉林大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘楠;苏云金芽胞杆菌新cry基因克隆、表达与杀虫功能研究[D];东北农业大学;2009年
2 李云艳;雅安周公山苏云金芽胞杆菌基因资源研究和杀虫基因的克隆[D];四川农业大学;2008年
3 曲步云;千山苏云金芽孢杆菌的分离与cry基因克隆[D];东北农业大学;2010年
4 鲍鸣;鸡IFN-γ基因的克隆与原核表达[D];安徽农业大学;2005年
5 刘占通;猪α干扰素基因克隆、原核表达及抗病毒活性研究[D];河南农业大学;2005年
6 张怡;重组鼠抗人CD19单链抗体的构建和表达[D];浙江大学;2006年
7 郝敏;玉米与大斑病菌构成的不同互作中基因表达的研究[D];河北农业大学;2006年
8 黄志强;产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及其基因克隆[D];福建农林大学;2006年
9 武鸿;嗜热脂肪地芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D];浙江大学;2007年
10 余国武;腊梅脂转移蛋白基因克隆与功能的初步分析[D];西南大学;2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 刘越西 徐仁元 记者 金姝;世界首例赖氨酸转基因克隆奶牛在吉大农学部培育成功[N];吉林日报;2011年
2 记者 李秀萍;石河子大学转基因克隆绵羊研究取得突破[N];兵团日报(汉);2011年
3 黄勇娣;世界首例转基因克隆兔在沪诞生[N];解放日报;2007年
4 许沈华;什么是基因克隆[N];家庭医生报;2007年
5 王婷婷;我国完成世界首例转基因克隆兔实验[N];科技日报;2007年
6 曹斌;血癌新病毒基因克隆成功[N];团结报;2000年
7 王有佳;全球首例转基因克隆兔在沪诞生[N];人民日报;2007年
8 李建平;首例荧光转基因克隆猪所产猪崽再次被确认具有荧光特征[N];大众科技报;2008年
9 记者 王中宙;25只转基因克隆绵羊在内蒙古农业大学诞生[N];呼和浩特日报(汉);2010年
10 吴一福;四军医大构建HBV全基因克隆质粒细胞系[N];中国医药报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978