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《东北农业大学》 2010年
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千山苏云金芽孢杆菌的分离与cry基因克隆

曲步云  
【摘要】: 苏云金芽袍杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是一种具有高度特异性,对环境友好的微生物杀虫剂,其主要杀虫活性与其携带的编码杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)的cry基因密切相关,因此,cry基因研究便成为近几年研究的热点。到目前为止,国际上已经克隆了524种杀虫蛋白基因,但是随着Bt应用的不断扩大,随之出现了杀虫晶体蛋白有杀虫谱窄,杀虫活性低的缺点,而且部分害虫已经产生抗性。因此,寻找新的高毒力菌株及基因是解决昆虫抗性问题的有效途径之一。 本研究从辽宁省千山三个不同区域的土样225份分离得到22株苏云金芽孢杆菌,分离率为9.8%。伴孢晶体的类型有菱形、球形、不定形。利用26对通用引物PCR方法对以上分离的22株菌株进行cry型的鉴定:其中有6株菌株含有cry1类基因,表达134kD的蛋白;有2株菌株含有cry7类基因,表达130kD的蛋白。 在对QZG121株的PCR中发现了cry7类基因,有文献报道cry7对鞘翅目、鳞翅目、直翅目害虫有活性,经过PMD18-T载体克隆,核苷酸序列测定后经NCBI BLAST比对后发现该菌株中含有cry7Ab基因。根据已知的cry7Ab全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因编码区长3417bp,用软件翻译出1138个氨基酸残基,分子量为130kD。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为GU936713,并由Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab9。 同时,根据因公布cry1Ac基因的两端序列设计全长引物Q5UNX/QU3UNX,在菌株Q12中克隆cry1Ac的全长基因。该基因被Btδ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry1Ac28。cry1Ac28编码区长3537bp,由1178氨基酸组成,分子量为134kD。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为FJ198072。 通过构建原核表达载体,获得阳性重组质粒pEB-cry7Ab与pEB-cry1Ac,转入E. coli BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明cry7Ab9与cry1Ac28基因在E. coli BL21(DE3)中均能正常表达。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S476.12

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【参考文献】
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