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转Bt基因抗虫玉米田间试验与遗传稳定性分析

王延锋  
【摘要】: 近20年来,人们采用基因工程手段成功培育了一批抗虫、抗病、耐除草剂和高产优质的农作物新种质,取得了令人瞩目的成就。而一个转基因的植株获得后,通常还要对其后代进行一系列基因纯合鉴定、遗传稳定性的研究、农艺和经济性状的筛选、产业化过程中的种性保持等工作,所有这些过程都需要对目的基因进行跟踪调查,需要对大量的转基因后代进行筛选、鉴定。因此在转基因作物研究继续深入的同时,科学家们越来越重视转基因与常规育种技术的结合,并加强了对转基因作物后代性状的大田遗传表达与变异研究试验,为利用转基因技术进行作物种质创新,改良现有作物品种,最终实现作物转基因植株从实验室走向大田生产奠定坚实的基础。而基因转入宿主后的有效表达及其稳定遗传,则成为转基因植物实用化中的关键问题。 国内关于玉米转Bt基因及Bt玉米遗传稳定性有一些报道,但多数是在转基因株系的早期世代,以转化植株的性能和基因功能的分析以及对国外Bt玉米的利用效果评价为目的,以国内具有自主知识产权的基因转化获得的Bt玉米材料为基础的鉴定工作不多,尤其是在转Bt基因抗虫玉米高代自交系的遗传稳定性的研究还未见报道。 本研究对采用花粉管通道法转cry1Ah基因抗虫玉米高代自交系(及其后代)和采用基因枪法获得的转Bt cry1Ah和cry1Ie双价基因抗虫玉米植株,通过田间及室内玉米螟抗性鉴定,利用PCR、RT-PCR、Southern blot、Western blot、ELISA等各种分子检测手段对外源基因的遗传稳定性和遗传规律等进行了研究分析,获得的主要研究结果如下: 1.通过PCR检测确认了阳性转化植株,用Southern杂交进一步证实了Bt基因已整合到受体植物基因组,用RT-PCR验证了Bt基因在植物细胞中的转录,用Western杂交证实了Bt基因在植物细胞中的表达。遗传分析表明,Bt基因在遗传传递过程中符合孟德尔遗传规律,是单位点显性方式遗传。外源基因cry1Ah、cry1Ie和2mG2-epsps三个外源基因在转基因玉米基因组中完全连锁,表现为共分离,就像单个基因位点一样一起传递到下一代而没有分离。 2.Cry1Ah在同一转基因事件的不同植株间表达量有所不同,但经统计分析差异不显著;在不同转基因事件间的表达量存在显著差异;同一植株同一发育时期不同器官Cry1Ah的表达量不同,苞叶和叶片外源基因蛋白表达量比较高,花粉最低,各组织部位外源基因蛋白表达量顺序:苞叶叶茎雄穗雄穗柄雌穗尖籽粒花丝花粉。Bt杀虫蛋白在玉米中的表达具有时空特异性,不同生育时期,CryAh在叶片和茎中的表达量不同,呈动态下降趋势。 3.不同的转基因事件与不同常规玉米自交系进行杂交,杂交后代的外源基因表达量不同,这与亲本外源基因表达量高低及另一亲本的基因型有很大关系。要想得到高表达量的杂交后代,则需要选择外源基因表达量高的转基因自交系做亲本;通过玉米螟抗性鉴定和外源基因表达量的测定,表明外源Bt基因通过雌配子的传递频率高于通过雄配子的传递频率,因此尽量选择抗性亲本正向方式进行杂交,这样获得表达量高的杂交后代的几率会高一些。 4.无论是转cry1Ah单价基因抗虫玉米自交系及其杂交、回交后代,还是转cry1Ah和cry1Ie双价基因抗虫玉米经连续四代的田间、室内玉米螟抗性检测,结果对亚洲玉米螟均表现出很好的抗性,并且这种抗性可以逐代稳定遗传,说明外源Bt基因的导入对防治亚洲玉米螟的危害是有效的。通过ELISA对Cry1Ah蛋白表达量的检测,其变化规律与虫测结果基本一致,说明田间、室内鉴定与分子鉴定相结合能更准确地说明Bt杀虫蛋白对亚洲玉米螟的抗性强弱,进行相关分析,结果表明抗虫玉米Cry1Ah蛋白表达量与雄穗柄倒折率和室内生测7天幼虫死亡率具有显著的相关性,与食叶级别、百株隧道长度具有极显著的相关性。说明玉米中Bt蛋白含量的高低是转基因玉米对玉米螟产生抗性强弱的内因。 5.转cry1Ah和cry1Ie单、双价基因抗虫玉米及其后代与受体对照比较,在穗行粒数及秃尖长上有一定的差异,差异显著,秃尖变短和穗行粒数增加表现为产量的提高,而在株高、穗位高、穗长、穗粗、穗行数及千粒重上差异不大,经检验差异不显著。 6.转cry1Ah基因抗虫玉米与受体对照比较,除了在栽培地试验时产量比受体自交系高外,在栽培地、荒地条件下,其出苗率、长势、株型、生育期、株高等方面均无显著差异;在荒地条件下,玉米出苗率均很低,撒播处理的出苗率还不到5%;杂草的覆盖度高于玉米的覆盖度,存在显著或极显著差异,说明玉米的生存竞争能力要远远小于杂草;种子发芽试验显示,转cry1Ah基因抗虫玉米后代种子发芽活力方面与对照也无显著差异。 7.确定了“两高—阳—优良”(即抗虫性高、外源基因蛋白表达量高、PCR检测为阳性、农艺性状优良)的转基因抗虫玉米筛选原则。依据这个筛选原则从转cry1Ah单价基因抗虫玉米中筛选出5个抗性好、农艺性状优良的纯合转化事件,分别为P66、P33、P25、P26和P14。从转cry1Ah和cry1Ie双价基因抗虫玉米中也筛选出1个纯合转化事件(S8)。


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