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《东北农业大学》 2010年
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表达口蹄疫病毒结构蛋白VP1重组牛疱疹病毒1型的构建及其免疫研究

朱远茂  
【摘要】: 牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)和口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)均为牛重要病原,呈世界性分布,给养牛业造成巨大的经济损失。BHV-1基因组约为138 kb的双链DNA,含有多个病毒复制非必需基因,可允许外源基因的插入,是构建多价牛传染病疫苗的理想载体。2005年在我国数省区爆发FMDV Asial,造成了巨大的经济损失。FMDV结构蛋白VP1能刺激机体产生细胞免疫和体液免疫,是研究FMD基因工程疫苗的首选蛋白。 本研究人工合成了Asial IND 49197(GenBank AY687334.1)VP1全基因,对VP1基因进行了原核表达并制备特异性的多克隆抗体。首先利用PCR方法扩增获得VP1全基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,在大肠杆菌BL21中进行表达。SDS-PAGE结果显示表达产物分子量约为31.6 ku,以包涵体形式存在。通过Ni-NTA Purification System纯化后进行Western blotting与间接ELISA分析,结果显示重组蛋白能够被FMD阳性血清识别,具有良好的反应性。将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,该抗体ELISA效价为1:20480,琼脂免疫扩散试验效价为1:64,病毒中和试验效价为1:64。 在构建表达FMDV Asial VP1重组BHV-1时,利用前期已经构建好的转移载体pGEM T-gE-/LacZ+,该载体含有在巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)早期启动子和BGH PolyA调节信号控制下的LacZ报告基因,同时含有BHV-1同源重组上下游臂,并利用人工合成含有VP1全基因质粒pUC57-AsiaVP1。以限制性内切酶XabⅠ和KpnⅠ双酶切质粒pGEM T-gE-/LacZ+和pUC57-AsiaVP1,通过回收目的片段、连接和转化等技术手段用VP1基因替换掉LacZ基因,最终获得含VP1表达盒且gE基因缺失的转移载体。采用磷酸钙介导转染法将该转移载体与前期获得的gE基因缺失并表达LacZ基因的重组病毒rBHV-1/gE-/LacZ基因组DNA共转染牛鼻甲细胞,采用反向病毒蚀斑筛选,获得表达VP1基因的重组病毒rBHV-1/gE-/AsiaVP1。PCR鉴定结果表明VP1基因成功重组到rBHV-1/gE-/AsiaVP1基因组中,间接免疫荧光试验和Western blotting证实VP1基因在rBHV-1/gE-/AsiaVP1感染的细胞中获得了表达。在MDBK细胞中连续传25代,PCR鉴定结果表明VP1基因在rBHV-1/gE-/AsiaVP1中稳定存在。rBHV-1/gE-/AsiaVP1与亲本病毒rBHV-1/gE-/LacZ+的TCID50测定结果分别是108.43/mL108.33/mL,表明他们之间的增殖能力差别相似。 将15只2kg~3kg的健康新西兰白兔随机分成三组分别于颈部皮下注射1ml 108.33TCID50 /mL rBHV-1/gE-/LacZ+,1ml 108.33 TCID50/mL rBHV-1/gE-/AsiaVP1和未免疫对照组,首免3周后以同样剂量加强免疫一次。6周后用IBRV强毒(IBRV/JL06)滴鼻攻毒,每只兔子剂量为0.5 ml 107.67 TCID50/mL。IBRV中和抗体检测结果表明首免后1周可产生1:4~1:16不等的抗体,加强免疫后抗体滴度均能达到1:128,并一直持续到本实验结束(8周),rBHV-1/gE-/AsiaVP1或rBHV-1/gE-/LacZ+所产生的IBRV中和抗体滴度基本没有差别。VP1抗体检测表明免疫rBHV-1/gE-/AsiaVP1 1周后可产生抗VP1蛋白的ELISA抗体,效价可达1:256以上,免疫2周后抗体达到高峰,并一直持续到本实验结束(8周)。攻毒后鼻拭子TCID50测定结果显示经rBHV-1/gE-/AsiaVP1或rBHV-1/gE-/LacZ+免疫的实验动物组排毒高峰出现在2~3天,排毒时间可持续5天,排毒最高时的平均TCID50/0.1mL分别为1.372和1.246;而未免疫实验组排毒高峰在攻毒后的第3-5天,排毒时间可持续8天,排毒最高时的平均TCID50/0.1mL为2.643。临床观察结果显示三组实验兔在攻毒后均出现有呼吸道临床症状如呼吸困难、精神沉郁等,但rBHV-1/gE-/LacZ+、rBHV-1/gE-/AsiaVP1免疫组比未免疫组要轻。攻毒后第6天每组安乐死2只实验兔,对采集的心、肝、脾、肺、肾、脑和淋巴结等组织进行病理学观察、间接免疫荧光(Immunofluorescence assay,IFA)检测和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)检查,结果显示rBHV-1/gE-/AsiaVP1或rBHV-1/gE-/LacZ+免疫组比对照组组织病理变化轻,荧光强度弱,组化阳性细胞少。 综上所述,本研究原核表达了FMDV Asial VP1基因并制备了兔多克隆血清,同时构建了VP1重组BHV-1。IBRV/JL06攻毒试验表明该重组病毒能够减少临床表现、缩短强毒排毒时间、降低强毒排毒强度并降低组织病理变化程度,表明具有保护作用。该重组病毒同时能刺激机体产生1:256以上的特异性VP1抗体。因此本研究构建的表达VP1重组病毒为研究BHV-1和FMDV二价活载体疫苗奠定了基础。
【学位授予单位】:东北农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.5

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 付培芬;表达1型鸭肝炎病毒VP1基因重组鸭肠炎病毒的构建及其生物学特性初步研究[D];东北农业大学;2012年
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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2 罗顺涛;田文洪;王刚;董小岩;杨莉;吴小兵;;用分泌型萤光素酶报告系统比较TTR启动子与CMV启动子的体内外表达特性[J];病毒学报;2009年06期
3 李继昌,童光志,仇华吉,周艳君,王玫,刘忠贵;表达牛流行热病毒G基因的重组牛传染性鼻气管炎病毒的构建[J];东北农业大学学报;2003年04期
4 唐泰山;王凯民;邓碧华;张常印;雷治海;;1株牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定[J];动物医学进展;2006年06期
5 王延涛;周玉龙;李国军;侯喜林;朴范泽;;IBRV DQ分离株gI基因的克隆与序列分析[J];动物医学进展;2007年09期
6 唐泰山;邓碧华;王凯民;张常印;雷治海;;牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立[J];动物医学进展;2009年04期
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中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 马鸣潇;FMDV分子背景分析、病毒拯救及多价基因工程疫苗研究[D];吉林大学;2007年
2 王芳;表达FMDV vp1基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究[D];中国农业科学院;2007年
3 海岗;表达FMDV vp1基因和山羊γ-干扰素基因的重组山羊痘病毒的构建及其生物学特性研究[D];中国农业科学院;2008年
4 陈关平;O型口蹄疫与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2008年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 褚秀玲;苏建青;韦旭斌;;水泡性口炎病毒人工感染小白鼠的免疫病理学研究[J];安徽农业科学;2008年30期
2 武刚;王洪梅;刘晓;王立群;于力;仲跻峰;何洪彬;;Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备[J];安徽农业科学;2011年05期
3 刘颖;冉多良;马扬;;正向间接血凝试验监测家畜O型口蹄疫抗体[J];现代农业科技;2007年19期
4 韩静芳;陈瑞爱;邵定勇;唐满华;梁桂益;;伪狂犬病毒TK基因缺失通用转移载体的构建及初步应用[J];现代农业科技;2009年15期
5 陈焕春,周复春,方六荣,何启盖,吴斌,洪文洲;伪狂犬病病毒鄂A株TK~-/gG~-/LacZ~+突变株的构建[J];病毒学报;2001年01期
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9 杜军利;张传溪;肖强;付建玉;殷坤山;;茶尺蠖核型多角体病毒荧光定量PCR检测方法的建立[J];茶叶科学;2010年03期
10 梁培禾;张克勤;聂志林;许桂莲;李彦锋;叶锦;靳风烁;;Flk-1_(265-2493)与C3d3基因融合质粒诱导小鼠免疫应答的初步研究[J];第三军医大学学报;2009年13期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 唐万勇;程国富;胡薛英;周诗其;;仔猪人工感染伪狂犬病毒鄂A株的病理学观察[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第十一次兽医病理学、第十次动物病理生理学学术研讨会论文集[C];2001年
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4 李尚波;马凤龙;马振宇;王文成;尹广东;孙洪丽;卫广森;王铁东;宣华;;猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
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8 吕素芳;郭广君;魏凤;唐娜;沈志强;;重组伪狂犬病病毒疫苗的研究进展[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集(2008)[C];2008年
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10 袁玉国;安礼友;杨廷佳;于宝利;赵俊辉;曹玉娟;成勇;;含双筛选基因的人乳铁蛋白乳腺特异表达载体的构建及其表达[A];中国畜牧兽医学会2010年学术年会——第二届中国兽医临床大会论文集(下册)[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 邵军军;Asia 1、O型口蹄疫病毒多表位疫苗的研究[D];甘肃农业大学;2011年
2 初小辉;吉林省猪伪狂犬病流行病学调查与防控措施的研究及应用[D];吉林大学;2011年
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5 姜焱;伪狂犬病病毒上海株gE~-/gI~-/GFP~+/LacZ~+缺失株的构建及其免疫原性初步研究[D];南京农业大学;2002年
6 范伟兴;PRV鲁A株的分离鉴定及表达EGFP和CSFV-E2的TK~-重组伪狂犬病毒的构建[D];南京农业大学;2002年
7 吴雨霞;口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因在原核和真核细胞中的表达[D];甘肃农业大学;2003年
8 覃雅丽;猪伪狂犬病鉴别诊断方法的研究及单克隆抗体的制备[D];华中农业大学;2002年
9 李义平;传染性法氏囊病病毒对CEF细胞某些基因表达的影响和传染性喉气管炎病毒的重组[D];中国农业大学;2004年
10 邵寒娟;A、O型口蹄疫双价疫苗研究[D];厦门大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 定明;牛传染性鼻气管炎TK/gE基因缺失重组病毒的研究[D];华中农业大学;2010年
2 何永龙;猪伪狂犬病、细小病毒病和乙型脑炎三联灭活疫苗的研制[D];华中农业大学;2010年
3 张先锋;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立[D];新疆农业大学;2010年
4 王若;口蹄疫病毒结构蛋白VP4基因的真核表达[D];河北农业大学;2010年
5 陈莉莉;口蹄疫病毒受体牛源整合素β6基因的研究[D];山东师范大学;2011年
6 王玮;骨骼肌特异表达卵泡抑制素基因转基因绵羊研究[D];内蒙古大学;2011年
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8 崔力凡;抗FMDV核酶的筛选及其重组成纤维细胞株的建立[D];中国农业科学院;2011年
9 赵俊;豚鼠模型评价牛口蹄疫Asia-1型灭活疫苗效力的研究[D];中国农业科学院;2011年
10 郑水长;RSKA/hIGF-Ⅰ真核表达质粒延缓失神经骨骼肌萎缩的实验研究[D];重庆医科大学;2011年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 张瀚元;YN株鸭肝炎病毒的分离鉴定及表达YN株VP1基因的重组鸭瘟病毒构建[D];东北农业大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前2条
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中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 张韩杰;双启动子表达载体的构建以及酯酶B1基因的表达[D];山东农业大学;2004年
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【相似文献】
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10 洪琦;口蹄疫—伪狂犬病二价与口蹄疫—猪细小—伪狂犬病三价基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 范翠翠;O型口蹄疫病毒VP1重组蛋白的表达及其免疫原性的研究[D];扬州大学;2008年
2 张先锋;口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC、3AB、3A的克隆表达及3A蛋白间接ELISA方法的初步建立[D];新疆农业大学;2010年
3 裴志花;牛O型口蹄疫病毒内蒙古疫苗株p1基因的克隆与序列分析[D];内蒙古农业大学;2005年
4 金华利;口蹄疫病毒vp1体外表达和DNA疫苗免疫效果的研究[D];新疆大学;2004年
5 孙琳;MUC1肿瘤抗原和口蹄疫病毒抗体检测方法的建立[D];吉林大学;2004年
6 王钢;口蹄疫病毒VP1基因的序列分析及巢式PCR检测研究[D];四川农业大学;2005年
7 田飞鹏;杆状病毒介导O型口蹄疫病毒P12A和3C基因在Sf9细胞和BHK细胞中的共表达[D];西北农林科技大学;2010年
8 杜宇;猪O型口蹄疫病毒VP_1基因的原核表达及重组蛋白的反应原性检测[D];山西农业大学;2005年
9 赵磊;抗口蹄疫病毒单克隆抗体的制备和抗原模拟表位的筛选[D];安徽农业大学;2008年
10 徐宗香;口蹄疫病毒VP2蛋白B细胞线性表位的鉴定[D];东北农业大学;2009年
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