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白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析

宋福南  
【摘要】:木质素为芳香族聚合物,是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质,主要存在于次生加厚的植物细胞壁中。可为植物提供机械支持,保护植物免受真菌入侵,陆生植物的木质素合成是适应陆地生活的重要特征之一。近几十年的研究已阐明了木质素单体的主要生物合成路线,并证明了木质素含量可被人为调控,并且通过木质素调控能够提高木本植物的制浆率和草料的可消化性等。同时,植物也能适应三种木质素单体(H/G/S) (?)司较大的比例变化。参与木质素生物合成途径的酶有十多种,其中咖啡酰辅酶A 3-O-甲基转移酶(CCoAOMT)是木质素生物合成途径中的一种关键酶,主要催化羟基辅酶A酯的甲基化反应,将咖啡酰辅酶A转化成阿魏酰辅酶A;4-香豆酸:CoA连接酶(4-coumarate:CoA ligase,简称4CL)是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A酯,是合成木质素与其它苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。 本论文首先分离了白桦肌动蛋白(Actin)基因的全长cDNA,该基因可作为实时定量表达技术的内参。根据不同植物肌动蛋白基因编码区的保守序列设计引物后进行RT-PCR,并采用RACE技术扩增出actin基因cDNA全长序列。白桦actin基因cDNA全长1785bp,其中5’非编码区157 bp,3’非编码区495 bp,编码区1134 bp,编码377个氨基酸。所得序列与GenBank中注册的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性均在80%以上,氨基酸序列的相似性高达96%以上,其高度保守性说明该基因与细胞生命活动密切相关,并对白桦4CL蛋白进行结构分析和同源建模。另外,利用RT-PCR和RACE技术从白桦次生木质部中克隆了编码苯丙氨酸解氨酶(PAL)的cDNA,其2322 bp的ORF编码773个氨基酸,其推导的氨基酸序列包含PAL-HAL和PAL两个功能域以及酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYIA。BplPALl基因在各组织中均有不同的转录表达,在次生木质部表达最强,其次是幼叶,在花序中的表达量较低,说明BplPAL1基因在各组织中的调控和表达是不同的。 其次,在前期已分离白桦的CCoAOMT和4CL全长cDNA(分别命名BplCCoAOMT1和Bpl4CL1)基础上,利用实时荧光定量PCR和Northern技术对BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因进行了mRNA水平的表达分析。Northern分析结果表明BplCCoAOMT1基因在7、8月份呈较高的转录水平表达。另外,利用实时荧光定量PCR分析白桦各器官和次生木质部在各时期的BplCCoAOMT1和Bpl4CL1基因的相对表达,结果显示6月底至7月初期间BplCCoAOMT1基因在次生木质部中的转录水平表达量较高,7月底达到最高峰。Bpl4CL1基因与BplCCoAOMT1基因相似,但Bpl4CL1基因在植物发育不同时期转录水平的表达差异更大。另外,Bpl4CL1基因与BplCCoAOMT1基因均在次生木质部中的表达量最高,其次是叶,而叶柄中最少。 通过根癌农杆菌介导法将BplCCoAOMT1基因反义分别导入烟草和白桦,利用前期已构建的植物表达载体p121-Bp1CCoAOMT1,对两个烟草品种龙江911和SR-1及白桦进行基因转化,并优化了组培系统。烟草两个品种的转基因程序相同,最终共得到252株卡那霉素抗性的烟草植株。利用外源基因特异引物进行PCR检测,252株中有115株呈阳性。组织化学反应检测结果表明,龙江911转基因植株阳性植株的S型木质素降低。5株转基因烟草的总木质素含量比对照平均降低了39.0%,方差分析显示转基因和非转基因植株的木质素含量差异极其显著。另外,优化了白桦的再生系统和转基因程序,初步推测转基因白桦植株的木质素组分有所改变。这些结果说明反义转化白桦BplCCoAOMT1基因在一定程度影响了了转基因植株木质素的生物合成,初步推测白桦BplCCoAOMT1基因参与木质素合成和S型单体合成。


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