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《东北林业大学》 2011年
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柽柳乙烯响应因子ThERF1的克隆和功能分析

李彦邦  
【摘要】:乙烯响应因子(ERF)是植物特有的一种转录因子,在植物对环境胁迫的应答方面起到重要的作用。ERF转录因子不仅能通过结合与病程相关皋因启动子中的GCC-box来调节它们的表达从而提高植物的抗病性,还能通过识别DRE和其他非GCC-box顺式作用元件参与植物的非生物胁迫的应答。 从柽柳cDNA文库中得到一条乙烯响应因子(Ethylene response factor, ERF)基因的EST序列,并命名为ThERF1。利用TAIL-PCR的方法获得ERF基因的完整序列,其开放读码框972 bp,共编码323个氨基酸,分子量为34.1 KDa,理论等电点为8.95。氨基酸序列分析表明,该ERF转录因子含有一个典型的ERF结构域,该区域中的第14和19位的氨基酸分别为丙氨酸和天冬氨酸,这是ERF类转录因子的一个典型特征。在C-末端含有一个EAR motif结构,所以该转录因子属于Class II族的ERF转录因子,可能起到转录抑制的作用。利用TAIL-PCR技术,克隆得到ThERF1转录因子的启动子序列1 071bp。通过PlantCARE数据库对序列进行分析,发现该启动子区域中除了包含多个启动子结构元件之外还包含多种信号传递和逆境响应相关的顺式作用元件,如ABRE、TGACG-motif, MBS和CGTCA-motif。 用以GAL4为基础的酵母单杂交系统研究ThERF1转录因子可识别的顺式作用元件。发现它既可以识别GCC-box又可以识别DRE顺式作用元件。当把GCC-box顺式作用元件核心碱基中第4、5位的胞嘧啶和第2、5位的鸟嘌呤突变后,ThERF1转录因子就失去了对其的识别能力。 为了研究与柽柳ThERF1转录因子相互作用的蛋白质,将ThERFl基因构建到酵母双杂交体系中的GAL4-BD载体中用作诱饵,从柽柳cDNA文库中筛选其互作蛋白。结果显示,ThERF1转录因子具有轻微的自激活活性,钓取到的5个能与其相互作用的蛋白质中有3个已知蛋白分别为乙醛脱氢酶(NAD+)、蛋白质延伸因子和ATP合成酶CF1亚基。 为验证ThERF1转录因子在抵御非生物胁迫应答中的功能,将ThERF1基因连接到35S启动子驱动的植物表达载体pROKⅡ中,通过农杆菌介导的浸花法将重组质粒转入拟南芥。通过抗性筛选和PCR验证,获得了转基因拟南芥共10个株系。
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