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辣椒轻斑驳病毒鉴定及种传初步研究

张娜娜  
【摘要】:辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)是一种严重危害辣椒生产的种传病毒。PMMoV侵染辣椒后,使辣椒呈现叶片皱缩、生长抑制、落花、果实变小等症状,对辣椒生产危害极大。PMMoV能够通过种子进行传毒,种内病毒可长时间存活并能随种子远距离传播。本研究探索基于dsRNA(double-stranded RNA)技术、DOP-PCR(degenerate oligonucleotide primed polymerase chain reaction)技术对病毒进行鉴定,并进一步对种子带毒、传毒情况进行分析。 1、利用改进的dsRNA提取方法,提取出了PMMoV特异dsRNA片段。利用琼脂糖凝胶试剂盒,将dsRNA进行切胶回收,获得了纯化的dsRNA,提高了dsRNA的纯度,且回收过程中dsRNA损失较少。 2、以回收的dsRNA为模板,进行DOP-PCR反应。根据dsRNA含量低、不易提取的特性,研究中将常规的一次DOP-PCR反应改为多次,使提取出的少量dsRNA扩增出了阳性条带。阳性条带切胶回收,并将胶回收产物进行克隆、测序,获得了2个PMMoV阳性克隆,将其分别命名为DOP-PMMoV1、 DOP-PMMoV2。将DOP-PMMoV1在GenBank中进行BLAST搜索,结果显示,DOP-PMMoV1序列长度为357nt,为PMMoV外壳蛋白基因片段,与GenBank收录号为AY859497、AB000709、 AB069853、 AB113117、AB113116、M81413、AJ308228的PMMoV不同分离物核酸序列的同源性最高,为100%;与GenBank收录号为JN540023的PMMoV分离物的序列同源性最低,为96%.DOP-PMMoV2序列长度为502nt,为PMMoV外壳蛋白基因片段,DOP-PMMoV2与GenBank收录号AY859497、AB000709、AB069853、 AB113117、AB113116、M81413的PMMoV不同分离物核酸序列同源性为93%。 3、以辣椒叶片、种子为实验材料,利用改进CTAB法提取核酸,利用PMMoV特异引物对辣椒植株中的PMMoV进行检测。不同引物组合都分别扩增出了预期片段,并经测序证明其为PMMoV的特异片段。以叶片、单种子为试材的RT-PCR反应中,PMMoV的检测灵敏度皆较高,叶片为试材的检测灵敏度略高于种子。本研究建立的RT-PCR体系可有效、高灵敏度的对种子中的病毒进行检测。PMMoV作为种传病毒,建立高灵敏度的检测体系对种子进行检验,在控制PMMoV经种子传播方面具有重要意义。 4、将感染病毒的阳性种子各部分用镊子和解剖针分离,利用RT-PCR技术,分别检测种子表面、种皮、胚乳、胚是否受PMMoV感染,检测结果显示,种皮和胚乳含有大量的病毒,种子表面也可检测到PMMoV,胚中未检测出PMMoV。说明PMMoV的种传方式为胚外感染,病毒未能侵入胚,病毒传入幼苗可能通过机械损伤等因素使种皮、胚乳中的病毒侵入种子。 5、利用RT-PCR技术,对商业种子中的PMMoV感染状况进行了分析。结果显示北京地区种子PMMoV感染率最高,沈阳地区种子PMMoV感染率居中,哈尔滨地区种子PMMoV感染率最低。种子产地为河北、山西、荷兰、鲁昌、北京、黑龙江的种子中均检测出PMMoV,其中北京产的种子带毒率最高,达到100%;产于内蒙古和甘肃的种子未发现PMMoV。尽管当前在种子生产及检验过程中对病毒及传播介体已进行了严加防控,但仍有部分种子带毒,说明加强病毒种传研究仍是较为迫切的。 6、小规模杂交实验显示,母本受PMMoV感染时,无论父本是否被PMMoV感染,所产生的种子含有PMMoV。母本未受PMMoV感染时,无论父本是否被PMMoV感染,所产生的种子中不含有PMMoV。因而种子是否带PMMoV,其决定因素在于母本的带毒情况,而与父本无关。


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