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《东北林业大学》 2015年
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分月扇舟蛾几丁质酶dsRNA转化杨树及其抗虫性的研究

谭嘉琳  
【摘要】:几丁质酶基因作为昆虫中重要的一种酶类基因,参与生物体生长发育期间的蜕皮及新表皮的形成过程。RNAi (RNA interence)作为一种重要的基因沉默方式,它在研究生物基因功能和防治方面得到了广泛的应用和研究。本文对分月扇舟蛾的几丁质酶基因进行了克隆,并根据其基因序列进行了它的生物信息学分析。以山新杨的叶片作为外植体,构建了几丁质酶基因Chi干涉表达载体pBI121-Chif-intron-Chir,利用根癌农杆菌介导法对山新杨进行遗传转化,并对转化株系进行了筛选、PCR检测,Chi基因的表达量的检测,并对其进行了抗虫性的研究,获得了如下主要结果:1、采用STE法提取分月扇舟蛾的RNA,并通过反转录获得cDNA,利用PCR技术对分月扇舟蛾的几丁质酶基因进行了克隆,并根据其测序的序列对其进行基因的序列分析,了解它的氨基酸组成及含量,对其氨基酸序列进行了保守区和神经肽的预测,并与其氨基酸序列相似的27种几丁质酶基因进行了多序列对比并作出进化树,构建出几丁质酶基因的蛋白质三级结构模型。2、提取分月扇舟蛾的基因组DNA,利用PCR技术克隆得到分月扇舟蛾神经肽PBAN基因的第三个内含子部分序列。以分月扇舟蛾的RNA为模版,利用PCR技术克隆得到Chi基因的保守区部分序列,然后将其正向和反向与PBAN基因内含子基因片段通过酶切连接转化等一系列的操作构建到中间载体pUC19上,并以卡纳霉素作为筛选基因抗生素的干涉表达载体pBI121-Chif-intron-Chir。最后将重组载体成功的导入到农杆菌EHA105中。3、以山新杨作为外植体,对其进行抗生素的敏感性测定,并建立了最佳的遗传转化体系,通过选择培养获得了具有目的片段的转基因山新杨植株,并通过PCR技术最终确定获得了7株具有目的片段的转基因山新杨植株,通过荧光定量PCR确定了7种转基因山新杨株系中表达量T4T7T2T6T5T3T1.4、对含有Chi基因的RNAi转基因山新杨进行组织培养,扩大繁殖,饲喂分月扇舟蛾通过荧光定量PCR发现Chi基因含量均降低,转化株系T3变化最为明显,T6转基因株系的变化最小。饲喂舞毒蛾,发现转基因山新杨株系对舞毒蛾的发育历期、体重和死亡率均无明显影响。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S763.7

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