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《东北林业大学》 2015年
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纤维素酶生产菌的筛选、诱变及产酶机制的初步研究

田海娇  
【摘要】:随着生活水平的提高、人口的增长和工业化进程的加速,全球能源需求逐渐增加。由此产生的能源安全、石油消耗、全球变暖等问题促使世界各国加快对替代能源的研究。生物燃料中纤维素乙醇的开发利用已成为研发热点。天然木质纤维素是公认最廉价且贮量最丰富的生物质资源。其主要成分为纤维素、半纤维素、木质素。生物降解纤维素主要通过纤维素酶来实现,而纤维素酶生产要依靠微生物进行。利用诱变、基因工程等技术对现有菌种进行改造提高酶活,是筛选高效纤维素酶生产菌最有效手段。本研究旨在筛选具有强纤维素酶生产能力野生型真菌。以腐烂的野草、树叶、秸秆为微生物源,以天然纤维素为唯一碳源的培养基富集培养,划线分离后接入液体培养基,以滤纸酶活为指标,筛选出一株菌能以纤维素为唯一碳源存活并产酶。采用26SrDNAD1/D2区测序的方法对菌株进行种属鉴定,结果为木霉Trichoderma sp,菌株定名为Trichoderma sp.A6。优化培养体系以提高酶活;结果显示添加10 g/L的乳糖可以使滤纸酶活由原始的最高值的0.16 IU上升到0.56 IU,且在培养2d后即已经达到整个培养过程中的最大值;乳糖酸的添加不能提高体系的滤纸酶活;添加吐温80对培养体系4d的酶活有微弱促进作用;15g/L添加酵母提取物可以使体系2d的滤纸酶活由0.60 IU提高到0.92 IU;酵母提取物与吐温80联合添加与单独添加对酶活增加的效果并不显著。确定最适培养条件为:乳糖和酵母提取物两者的添加比例分别为10 g/L和15 g/L。以菌株Trichoderma sp.A6作为出发菌株进行紫外诱变,经大量筛选获得纤维素酶高产诱变菌株2-3D。纯化并继代培养确保其遗传稳定性后,分别采用摇床培养和液体深层发酵,提取纤维素酶粗酶液,测其CMC和滤纸酶活,分别达1.44 IU和1.04 IU,抽滤过滤粗酶液,利用单宁沉淀析出酶蛋白,真空冻干浓缩,获得的酶粉末的酶活性大幅提升,较出发菌株高出近5倍。该菌株经多次重复传代培养验证,酶活力变化不大,具有较高遗传稳定性,发酵周期短,产酶水平高。为深入探究诱变效果,对菌株进行高通量测序获得转录组,数据分析结果显示全部序列平均长度约98bp; De novo拼接得到15763个unigene,总大小20.37Mb;转录本总量达21594条,平均长度1572.65bp; GC比正态分布,集中于50%-60%;有76%的基因被注释到其源头菌株里氏木霉QM6a; KOG功能预测,有109个基因注释于氨基酸生物合成代谢途;分析了两个基因(KO号ko00010, ko00190)在代谢中的作用;差异表达显示诱变菌和出发菌相比有1549个基因表达量下调,267个上调,共1816个发生变化;GO富集显示DNA复制与代谢、木聚糖合成代谢与分解代谢、半纤维素酶代谢均有较多基因差异表达。表达极其显著的代谢途径有DNA复制和酵母细胞循环。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:Q93

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 关铜,张世华;纤维素酶在饲料工业中的研究与应用[J];贵州畜牧兽医;2003年05期
2 邱雁临,王金华,吴周和,王伟,李秀芳;纤维素酶酶活的影响因子初探[J];湖北农业科学;2003年05期
3 勇强,李树炎,陈牧,徐勇,余世袁;氮源对里氏木霉木聚糖酶和纤维素酶生物合成的影响[J];林产化学与工业;2004年03期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 佟勇;产纤维素酶放线菌及其酶学性质和淡水湖底泥微生物区系研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 邵喜霞;韩大勇;张力;;绿色木霉合成纤维素酶部分培养条件的优化[J];Animal Husbandry and Feed Science;2009年03期
2 武秀琴;王敏;;纤维素酶高产菌株的诱变选育[J];安徽农业科学;2008年23期
3 邵喜霞;韩大勇;张力;;绿色木霉合成纤维素酶部分培养条件的优化[J];安徽农业科学;2009年23期
4 巫小琴;徐强;李燚;陶诗;黎勇;;纤维素酶产生菌的分离及其酶活力测定[J];安徽农业科学;2009年35期
5 陈亚平;王白娟;刘鲁峰;彭谦;赖泳红;;碱性纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件的研究[J];安徽农业科学;2010年17期
6 赵桂华;席刚俊;;产酶微生物及其应用[J];安徽农业科学;2010年36期
7 祝小;王振华;潘康成;吴敏峰;;产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究[J];现代农业科技;2006年11期
8 陈小玲;陈东;芦志龙;;瑞氏木霉内切-β-1,4葡聚糖酶基因Egl1的分子改造[J];广西科学;2011年03期
9 田海娇;吴昊;杨洪岩;;提高纤维素酶产生菌产酶能力方法的研究进展[J];安徽农业科学;2014年05期
10 白洪志;杨谦;宋金柱;陆书亮;;纤维素降解菌绿色木霉C-08产酶条件研究[J];哈尔滨工业大学学报;2008年07期
中国重要会议论文全文数据库 前3条
1 姜晓云;王家德;;纤维素酶及其在废木质纤维素制可还原糖中的应用[A];2009全国可再生能源—生物质能利用技术研讨会论文集[C];2009年
2 柳建设;肖利;夏乐先;谢景洪;;枯草芽孢杆菌发酵生产纤维素酶的研究[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
3 葛春辉;徐万里;邵华伟;张云舒;孙宁川;钟新才;王伟;;两株产纤维素酶芽孢杆菌的筛选及其纤维素酶部分特性[A];中国土壤学会第十一届全国会员代表大会暨第七届海峡两岸土壤肥料学术交流研讨会论文集(下)[C];2008年
中国博士学位论文全文数据库 前6条
1 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
2 燕红;两株芽胞杆菌纤维素酶诱导产生机制及其作用的研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
3 胡仕凤;木霉菌REMI突变株构建及其功能挖掘[D];湖南农业大学;2007年
4 赫荣琳;TrATG5基因对里氏木霉生长发育的影响[D];浙江大学;2009年
5 何力;草鱼纤维素分解菌筛选、酶提纯及其相关活性研究[D];华中农业大学;2008年
6 林白雪;厦门近海温泉微生物多样性及热稳定纤维素酶的研究[D];福建农林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 桂春燕;耐盐碱产纤维素酶芽孢杆菌的选育及酶学特性的研究[D];山东农业大学;2010年
2 杨友坤;堆肥中产纤维素酶真菌的筛选、产酶条件及应用研究[D];浙江农林大学;2010年
3 蒋琼凤;纤维素酶高产菌株的选育[D];湖南农业大学;2010年
4 白玉;嗜热子囊菌内切葡聚糖酶Ⅰ基因的DNA改组及酶学性质的研究[D];河北农业大学;2011年
5 张宁;高效厌氧纤维素降解菌复合菌系的构建及应用研究[D];河北师范大学;2011年
6 董硕;产低温纤维素酶菌株筛选及发酵条件研究[D];大连大学;2011年
7 秦伟;Bacillus.sp.bs-1的内切葡聚糖酶在大肠杆菌中的表达研究[D];内蒙古农业大学;2011年
8 刘靖;斜卧青霉纤维素酶液态发酵工艺研究[D];内蒙古农业大学;2011年
9 刘羽;南极低温纤维素酶在同步糖化发酵中的应用的研究[D];中国海洋大学;2011年
10 石文卿;纤维素高效降解菌的筛选及应用研究[D];湘潭大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王静;牛仔布纤维素酶“洗旧”整理工艺参数的研究[J];安徽农业大学学报;1997年01期
2 刘昭壮,任大明;浅谈饲用纤维素酶的生产与应用[J];饲料工业;1995年03期
3 陈冠军,杜宗军,高培基;耐碱性真菌纤维素酶生产菌的筛选及酶学性质的初步研究[J];工业微生物;2000年04期
4 何开丽;巢湖富营养化现状与治理对策[J];环境保护;2002年04期
5 董志扬,祝令香,于巍,林敏,平淑珍;纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究[J];核农学报;2001年01期
6 王玢,汪天虹;冷活性纤维素酶性质研究[J];海洋科学;2004年02期
7 勇强;植物纤维资源高效生物利用[J];林业科技开发;2002年03期
8 段金柱,曹淡君;固体发酵与液体发酵生产纤维素酶产率与催化性能比较[J];粮食与饲料工业;2000年03期
9 曾文青,刘蓉,曾勤;纤维素酶系高产菌株的选育[J];四川省卫生管理干部学院学报;2000年01期
10 梁霆,王遂,莫志忠,刘凤元,刘波;纤维素酶液体深层发酵条件的研究[J];生物技术;1997年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 魏亚琴;李红玉;;纤维素酶高产菌选育研究进展及未来趋势[J];兰州大学学报(自然科学版);2008年S1期
2 张宇;许敬亮;袁振宏;庄新姝;李东;;纤维素酶固定化载体的研究进展[J];生物质化学工程;2009年01期
3 谢敬;;纤维素酶的研究进展[J];化学工业与工程技术;2010年05期
4 杨苏宁;;纤维素酶及其应用综述[J];科技传播;2011年15期
5 刘慧琳;曹以诚;杨磊;黄昱阳;曾炳佳;;白蚁纤维素酶结构域重组研究[J];广东农业科学;2011年09期
6 乞永立;耿月霞;任章启;;纤维素酶的生产及应用[J];适用技术市场;2000年06期
7 ;液体深层发酵生产纤维素酶[J];河北工业科技;2001年01期
8 邱雁临,王金华,吴周和,王伟,李秀芳;纤维素酶酶活的影响因子初探[J];湖北农业科学;2003年05期
9 周桂,何子平,邓光辉,黄在银,谭学才;纤维素酶与淀粉酶降解壳聚糖的动力学研究[J];海洋科学;2003年11期
10 王金华,李冬生,夏服宝;纤维素酶对蚕蛹蛋白酶解的促进作用[J];食品科学;2003年07期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王骥;丁明;李燕红;陈清西;许根俊;赵辅昆;;动物内源性纤维素酶:福寿螺(Ampullaria crossean)多功能纤维素酶基因的克隆[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2003年学术交流会论文摘要集[C];2003年
2 冯文英;;固体纤维素酶的浸渍条件优化及其特性研究[A];中国造纸学报2003年增刊——中国造纸学会第十一届学术年会论文集[C];2003年
3 赵辅昆;王骥;陈清西;许根俊;;纤维素酶的研究进展[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
4 姚强;黄琰;陈冠军;;产耐碱性纤维素酶丝状真菌的筛选及研究[A];山东微生物学会第六次会员代表大会暨2004年学术年会论文集(上)[C];2004年
5 刘淑艳;卢雪梅;段新源;高培基;;中温纤维分解真菌尖镰孢Fusarium oxysporum的一种新的耐热内切纤维素酶[A];中国资源生物技术与糖工程学术研讨会论文集[C];2005年
6 黄燕华;冯定远;;不同来源纤维素酶的酶活最适条件研究[A];酶制剂在饲料工业中的应用[C];2005年
7 李艳丽;许尧兴;许少春;;碱性纤维素酶研究进展[A];浙江省生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2005年
8 王春燕;刘四新;;宏基因组技术在纤维素酶活筛选中的研究进展[A];2009年海南省微生物学检测及质量保证研讨会论文集[C];2009年
9 王在贵;何瑞国;钱世钧;刘朝良;;特异腐质霉纤维素酶的酶谱分析[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
10 李汉骏;王舒;付鸣佳;;产纤维素酶真菌Mucor amphibiorum RSC1的鉴定和产纤维素酶特性的研究[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2010年学术交流会论文集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 平远 译;纤维素酶可提高秸秆饲料利用率[N];福建科技报;2004年
2 河北农业大学动物科技学院 孙洪新甄二英;纤维素酶在动物营养中的应用[N];中国畜牧兽医报;2008年
3 王菁莎 王颉 刘景彬;纤维素酶的应用现状[N];中国食品质量报;2009年
4 刘国信;开发纤维素酶制剂大有可为[N];经理日报;2004年
5 陆慕寒 整理;35项印染行业节能减排先进技术——助剂篇(二)[N];中国纺织报;2008年
6 山东农业大学 王纪亭;饲料原料资源匮乏出路何在[N];中国畜牧报;2003年
7 ;2009年印染行业节能减排优秀技术创新成果推介[N];中国纺织报;2009年
8 冯卫东;科技将这样改变我们的生活[N];科技日报;2008年
9 ;高活力纤维素酶生产技术 [N];中国化工报;2002年
10 本报记者 李晓岩;生物炼制:突破纤维素利用瓶颈[N];中国化工报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 周峻沛;云斑天牛胃肠道内共生细菌来源的纤维素酶和半纤维素酶的初步研究[D];中国农业科学院;2010年
2 韦小敏;斜卧青霉胞外蛋白质组学分析与纤维素酶合成调控机制研究[D];山东大学;2011年
3 廖红东;磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究[D];湖南大学;2010年
4 王玉国;新型嗜热纤维素酶的性质研究及协同水解纤维素作用[D];吉林大学;2011年
5 李兴华;纤维素酶产生菌的筛选及纤维素酶基因在家蚕中的表达研究[D];浙江大学;2011年
6 余圆圆;纤维素酶修饰及其对纤维素纤维作用的研究[D];江南大学;2014年
7 俞梅兰;EGA-GFP和CD-GFP对纤维素纤维的作用机理及应用研究[D];浙江理工大学;2015年
8 吴淑芳;重组内切纤维素酶酶学性能及其应用研究[D];南京林业大学;2005年
9 张名佳;纤维素酶高效水解、回收再用与反应机理的研究[D];天津大学;2010年
10 刘小杰;康氏木霉纤维素酶的发酵及其对稻草降解利用的初探[D];浙江大学;2003年
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1 石矛;纤维素酶工程菌的构建及表达[D];吉林农业大学;2008年
2 郑德;瘤胃纤维素降解微生物的筛选及产纤维素酶酶学性质的研究[D];南京理工大学;2010年
3 董俊丽;深海细菌Martelella mediterranea纤维素酶基因的克隆、表达与酶学分析[D];华中农业大学;2010年
4 杨春燕;纤维素酶发酵生产及其降解秸秆性能研究[D];天津大学;2010年
5 蒋西然;耐高温纤维素酶在烟草中的表达[D];大连理工大学;2011年
6 李收;微生物发酵法生产纤维素酶[D];山东轻工业学院;2011年
7 李保深;一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及代谢产物的研究[D];东北林业大学;2011年
8 刘靖;斜卧青霉纤维素酶液态发酵工艺研究[D];内蒙古农业大学;2011年
9 吴海洪;福寿螺纤维素酶的研究[D];浙江大学;2006年
10 董志刚;高温放线菌纤维素酶的研究[D];广西大学;2006年
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