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《东北林业大学》 2017年
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沙枣接种AM真菌和共生固氮放线菌对盐胁迫的响应

平原  
【摘要】:沙枣(Elaeagnus angustifolia),是胡颓子科胡颓子属落叶乔木。沙枣常常作为防风固沙和城市建设的绿化树种,具有很高的生态和经济价值。特别是作为耐盐碱植物,在盐碱地修复方面有着重要的作用。在前期研究中发现,沙枣的根际既存在结瘤放线菌又存在丛枝菌根真菌(AMF)。而目前对于沙枣、AMF和结瘤放线菌这种三位一体的共生关系研究很少。本研究对黑龙江省肇东市引种沙枣试验田进行沙枣根际微生物多样性和土壤理化性质进行研究,并分离培养能够固氮结瘤的放线菌和沙枣根际优势AMF菌株,将其接种于沙枣幼苗根际,并做盐胁迫处理,结合分子和理化性质检测方法,针对AMF和固氮放线菌对沙枣的生理和分子响应进行研究,旨在揭示接种AMF和放线菌促进沙枣耐盐碱的作用机制,具有一定的创新意义。主要研究结果如下:1.通过对沙枣种植地三种不同栽种期的沙枣根和根际土壤取样,测定其根际菌根侵染率和放线菌数量。明确了沙枣根际的土壤理化指标存在着显著差异,随着年份的增长,速效磷、全氮、土壤含水量、放线菌数量和AMF孢子数量显著增加,pH值和电导率显著降低。通过这些指标与沙枣根际土壤微生物数量指标做相关性分析可知,这种变化与沙枣根际微生物存在密切的相关性,并且研究发现放线菌数量与AMF孢子密度也呈显著正相关,进一步证明了沙枣根系放线菌和AMF能够与沙枣形成共生关系,从而改善沙枣根际土壤的肥力,达到土壤修复的目的。2.用蔗糖湿筛离心法分离AMF孢子,计算物种相对多度和分离频度,根据AMF孢子的形态结构进行初步鉴定,对LSU-ITS-SSU区进行PCR扩增并分子鉴定,获得了 5种AMF与沙枣植株共生,分别为缩隔球囊霉(Septoglomus constrictum)、聚丛球囊霉(Rihizophagus aggregatum)、根内球囊霉(Rhizophagus intraraices)、苏格兰管柄囊霉(Funneliforrmis caledonius)、摩西管柄囊霉(Funneliforrmis mosseae),其中R.intraradices 为优势菌。3.对沙枣根际土壤和根瘤中的放线菌进行分离培养,分离得到沙枣根际的放线菌有6科10属127种。利用无氮培养基对127株菌进行培养,结果发现能在无氮培养基上生长的菌株有80株。提取80株菌的基因组,针对nifH和nodA基因进行PCR扩增,结果发现,其中具有固氮功能的放线菌有22株。利用16srRNA进行分子鉴定,22株菌中鉴定出7株菌,分别为堆孢链霉菌(Streptomyces massasporeus)、绿青链霉菌(Streptomyces iakyrus)、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、林肯链霉菌(Streptomyces lincolnensis)、维及尼链霉菌(Sreptomyces virginiae)、暗黑橄榄链霉菌(Streptomyces olivoviridis)和Streptomyces pratensis。其中只有Streptomyces pratensis 既有nifH基因又有nodA基因。4.将筛选出的丛枝菌根真菌Rhizophagus intraradices(R.i.)和放线菌Streptomyces pratensis(S.p.),单接种和双接种在盆栽沙枣幼苗上,在300mM NaCl浓度下盐处理30d后,用光合仪测定沙枣幼苗的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间CO2浓度。结果发现,在受到盐胁迫时,双接种处理能够有效的提高沙枣幼苗的光合速率,降低气孔导度,减少蒸腾率。5.测定了盆栽沙枣幼苗植株的基茎、株高和干重等地上生长指标,以及根长、根投影面积、根面积和根体积等地下根形态。结果表明,在加盐条件下,除了 R.i处理的根体积大于其他处理外,其他指标都显示为R.i.+S.p.处理R.i.或S.p.处理CK处理。受到盐胁迫时,双接种R.i.+S.p.处理能够显著提高植株的生物量。6.开展了沙枣根际土壤过氧化氢酶、磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性。无论是盐处理还是未加盐处理条件下,R.i.+S.p.处理幼苗根际土壤的酶活性都大于其他处理。在盐处理条件下,单接S.p.处理的脲酶活性大于R.i.处理的酶活性,而其他酶活均相反。双接种R.i.+S.p.能够有效提高沙枣幼苗的土壤酶活,单接S.p.处理比单接R.i.能够提高土壤脲酶活性的酶活。7.测定了沙枣叶片中PRO和MDA的含量及CAT、SOD和POD酶活性。加盐条件下,双接种R.i.+S.p.显著提高幼苗SOD、POD、CAT活性和PRO含量,并能有效降低MDA的含量。而单接R.i.的沙枣幼苗酶活性高于单接S.p.处理,单接S.p.的幼苗MDA含量高于单接R.i.处理。在盐胁迫条件下,双接种R.i.+S.p.处理能够有效提高沙枣植株氧化酶活性,提高脯氨酸含量,有效降低丙二醛含量,促使植物能够正常生长,而单接种放线菌的效果没有单接种AMF的效果好。8.利用火焰吸收法测定了 Na+、K+离子含量,并计算K+/Na+比值。在盐处理条件下,CK处理的幼苗Na+浓度最高,双接种R.i.+S.p.的幼苗Na+浓度最低。K+浓度和K+/Na+比率均为双接种处理最高,单接种处理最低。由此可见,盐胁迫下,双接种R.i.+S.p.于沙枣幼苗上能够有效的降低叶片中的Na+浓度,提高K+/Na+比值。9.测定不同处理沙枣幼苗的菌根侵染率和放线菌结瘤率,在盐胁迫下单接种R.i.菌根侵染率为50.67%,接种R.i.+S.p.菌根侵染率为54.67。在不加盐的处理中接种R.i.菌根侵染率为70.67%,接种R.i.+S.p.菌根侵染率为77.33%。沙枣根际结瘤率分别为7、8、7.67、9.33、13.33。AMF的侵染率与株高存在显著的正相关性,结瘤率与钾离子含量存在正相关性。进一步证明AMF对提高沙枣植株生物量起着重要作用。10.采用实时荧光定量PCR技术研究沙枣叶片脯氨酸合成酶相关基因P5CS相对表达量和放线菌固氮酶相关基因nifH的相对表达量,结果发现两者在转录水平上均为上调反应,且双接种R.i.+S.p.处理的相对表达量均高于单接种处理。P5CS基因的表达量与脯氨酸含量呈正相关。nifH基因转录水平上的表达与根际土壤中脲酶活性存在负相关。11.利用宏基因组测序的方法探究盐胁迫下接种R.i.和固氮放线菌S.p.处理的沙枣根际微生物群落组成和代谢通路相关基因。研究结果表明:共得到7932666条ORFs,平均每个样品881407条ORFs;GC含量为62.69%,完整基因有973472个,占所有非冗余基因总数的17.87%。主要的微生物菌门分为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝细菌门(Cyanbactiria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)和绿菌门(Chlorobi)。主要包括的代谢通路全通路(新陈代谢通路、次生代谢产物的合成、抗生素生物合成、碳代谢、2-氧代羧酸代谢、脂代谢、氨基酸合成和芳香族化合物的降解)、碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢、辅因子和维他命代谢和膜转运有着密切关系。其中在盐胁迫下主动防御的代谢通路为膜转运,被动防御的代谢通路有碳水化合物代谢通路、氨基酸代谢通路、辅因子和维他命代谢通路。在盐胁迫条件下,接种AM真菌和放线菌会明显改变土壤微生物群落结构和功能,使得土壤微生物结构和功能发生改变,并且结构和功能的变化规律是一致的,而且添加AM真菌和放线菌会抵消盐处理对沙枣土壤根际土壤微生物结构和功能的影响,增强沙枣对盐胁迫的抗性。随着沙枣栽植年份的增加,其修复盐碱土壤的效果越明显。使沙枣起到修复盐碱地的作用因素是沙枣根际的AMF和能够与其形成根瘤的放线菌。在盐胁迫条件下,两种微生物协同作用能够提高沙枣植株光合作用、生物量、土壤酶活性和抗盐碱相关酶的活性。本文研究成果为盐碱地的生态治理提供了理论依据,为沙枣的菌根化培育奠定了基础。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S793.6

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