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《东北林业大学》 2017年
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鸽疱疹病毒全基因克隆及DNA疫苗的制备

郭颖  
【摘要】:鸽疱疹病毒(Pigeon herpesvirus,PiHV)又称哥伦比亚疱疹病I型(Columbid herpesvirus 1,CoHV-1),是禽疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科、马立克氏病毒属的一员。患病鸽子临床症状主要表现为厌食、精神不振等,少数有结膜炎和神经症状。鸽子是该病的主要宿主,同时也是我国主要经济养殖动物,所以鸽疱疹病毒对养鸽业造成了一定经济损失。目前还未有能预防CoHV-1传播且能阻止该病复发的特效药物,因此,研制安全、长期有效的CoHV-1疫苗已成为预防病毒感染的关键。DNA疫苗,又称基因疫苗,是一种新型疫苗,它的的出现改善了一些疱疹病毒病的防治工作,目前有很多疱疹病毒DNA疫苗的免疫成功案例,如马立克氏病毒、传染性喉气管炎病毒等。2013年,本实验室于黑龙江省哈尔滨康达禽病技术咨询服务中心的患病野鸽中分离出CoHV-1黑龙江株(下简称CoHV-1-HLJ株)。虽然,国内外陆续报道称已从鸽子、猛禽体内都有分离出CoHV-1,但是CoHV-1基因组序列的相关研究甚少。本研究参考多个禽α疱疹病毒基因组序列,设计95对引物,采用常规PCR与单侧寡聚核苷酸嵌套PCR(SON-PCR)相结合的方法,对CoHV-1-HLJ株进行分段克隆。使用DNAStar、ORF Finder、MrBayes等生物信息学软件对CoHV-1-HLJ进行了序列拼接及分析。CoHV-1-HLJ株基因组全长为204,237 bp(GenBank登陆号为:KX589235),具有典型的E型α疱疹病毒基因结构,共编码130个蛋白。进化系统分析发现CoHV-1-HLJ进化地位与其他禽α疱疹病毒一致,并与猎鹰疱疹病毒I型(FaHV-1)亲缘关系最近。而当将CoHV-1-HLJ株基因组序列与FaHV-1基因组序列进行比对发现,其同源性高达99.4%,且有74个氨基酸序列不一致,其中包括一些结构蛋白和功能蛋白。根据已获得的CoHV-1-HLJ株的gC、gD和gE基因序列设计三对引物,通过PCR方法分别扩增gC、gD和gE,并分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pgC、pgD和pgE。重组质粒经过弗氏佐剂乳化后免疫接种鸽子,并设灭活病毒组、空载体组和无菌PBS三组对照。动物实验表明:经过初次免疫和加强免疫后,三种DNA疫苗均可以诱导机体产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答,同时能够显著提地高了鸽子抵御致死剂量CoHV-1的能力。本研究首次克隆出野鸽疱疹病毒全序列,并对全序列进行了系统的测定,利用分子生物学方法分析鸽疱疹病毒与其他禽类疱疹病毒间的分子差异,为研究相应基因的功能奠定基础。同时,成功制备了三种CoHV-1 DNA疫苗pgC、pgD和pgE,为CoHV-1DNA疫苗的工业化生产奠定了基础。
【学位授予单位】:东北林业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:S852.65

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