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高油酸向日葵种子不同发育时期全转录组分析及HaFAD2基因功能鉴定

刘岩  
【摘要】:向日葵(Helianthus annuus L.)是世界上四大油料作物之一,提高向日葵种子含油量和改良其脂肪酸组成是向日葵品质育种的重要目标。植物油脂的生物合成涉及多层次、多水平的协同调控,目前关于植物油脂代谢分子调控机制的研究仍不够深入。本研究首先分析了三份油用向日葵保持系种子在不同发育时期重量、含水率、含油量和脂肪酸组成的变化规律,为向日葵种子发育及品质形成分子机理研究提供理论依据;以高油酸向日葵三个代表性发育时期的种子为材料,进行全转录组学测序分析,挖掘参与油脂代谢的基因和非编码RNAs,为阐明向日葵种子发育过程中油脂代谢的分子调控机制提供参考;对控制向日葵脂肪酸含量的关键候选基因HaFAD2进行基因功能分析和上游转录因子预测,为通过分子手段改良向日葵品质提供基因资源,并为今后HaFAD2转录调控机制研究奠定基础。主要研究结果如下:1、向日葵在种子发育过程中重量和含水率的分析结果表明,三份向日葵保持系种子在发育过程中百仁鲜重、百粒皮壳鲜重、百粒鲜重均符合先升高后降低的趋势,但不同材料性状变化趋势转变的时间点有所差异;鲜籽仁率、百仁干重、百粒干重和干籽仁率总体上均呈逐渐升高的趋势;百粒皮壳干重在种子发育前期增加,之后呈小幅度变化;子实含水率在开花后7-12 d升高,在开花后12-32 d逐渐下降,在发育后期下降速率明显增快。2、向日葵在种子发育过程中含油量和脂肪酸组成分析结果表明,三份材料含油量变化趋势基本一致,最大积累速率均出现在开花后17-32 d,开花后32-37 d含油量趋于稳定;在整个种子发育过程中硬脂酸(C18:0)和亚麻酸(C18:3)的相对含量均非常低;软脂酸(C16:0)含量都是在种子发育前期比较高,随着种子发育含量下降;油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)积累变化趋势基本相反。高低油酸向日葵油酸积累变化的差异表现在:高油酸向日葵油酸主要是在开花后7-12 d快速积累,而低油酸向日葵油酸在开花后12-22 d逐渐积累。对高油酸向日葵开花后7、22、37 d种子的37种脂肪酸含量进行测定,结果共检测出13种脂肪酸,其中22 d脂肪酸种类最多,37 d脂肪酸种类最少。3、选取高油酸向日葵开花后7、22和37 d的种子进行mRNAs、lncRNAs和circRNA测序,总共检测到237,767个转录本表达。将Fold Change≥2同时满足Pvalue≤0.001作为筛选的标准,L7d vs L22d 比较组中含有52293个mRNA、120625个lncRNA 和 2723 个 circRNA,L7d vs L37d 比较组中含有 57398 个 mRNA、123485 个lncRNA 和 2910 个 circRNA,L22d vs L37d 比较组中含有 15417 个 mRNA、9554 个lncRNA和1538个circRNA。KEGG代谢通路富集分析发现三组比较中均有一些差异表达基因、lncRNA靶基因和circRNA来源基因归类于油脂代谢相关途径,尤其circRNA来源基因显著富集在脂肪酸代谢相关通路中,表明circRNA对脂肪酸代谢通路中基因的表达可能存在重要的调控作用。表达量热图分析发现脂肪酸生物合成代谢途径中大部分DEGs在三个比较组中下调表达,表明这些基因中大部分随着种子发育表达量降低。油脂合成代谢通路中挑选8个DEGs的qRT-PCR与转录组测序检测的表达趋势全部一致,验证了全转录组测序结果可靠。4、对高油酸向日葵开花后7、22和37 d的种子进行miRNAs测序,共鉴定到268个miRNA,其中新的miRNA 98个。将Fold Change≥2同时满足Pvalue≤0.001作为筛选标准,L7dvs L22d、L7dvs L37d和L22d vs L37d三个比较组中分别含有95、127和77个差异表达miRNAs。三组比较中油脂代谢相关通路中的差异表达miRNAs有22个,表达量热图分析发现,22d vs 37d 比较组中大部分miRNA下调表达。通过差异表达miRNA与靶基因共表达分析发现,三个比较组中分别有56(L7d vs L22d)、79(L7d vs L37d)和31(L22dvs L37d)个差异表达miRNAs与靶基因呈负相关的共表达关系,其中有6对油脂代谢相关的miRNA和靶基因,表明这些基因的差异表达可能是miRNA调控的结果。分析与油脂代谢相关的ceRNA调控网络,发现一些可能受ceRNA网络调控的关键酶,包括甘油-3-磷酸-酰基转移酶、亚油酸9S脂氧合酶等。5、在脂肪酸和三酰甘油生物合成通路中筛选16个编码关键酶的基因,通过qRT-PCR检测这些基因在向日葵发育不同时期的种子以及叶、茎、管状花、舌状花、根中的表达,发现只有FAD2是种子中特异高表达基因。相关性分析结果表明:向日葵种子中C16:0 与 KASⅢ,C18:1 与 LPCAT、MCAT、FAD2、KASⅢ,C18:2 与 FAD2、KASⅢ,C18:3 与 KASⅢ,含油量与 EAR、DGAT3、LPCAT、PAH1、FAD2、MCAT、LACS4 的表达均呈显著相关,C18:0与这16个基因表达均不存在显著相关性。6、构建表达载体2301-HaFAD2-GFP,并瞬时转化至烟草叶片下表皮中,发现HaFAD2编码蛋白亚细胞定位在细胞质中。构建过表达载体2301-HaFAD2,浸花法侵染拟南芥,经Kana生根筛选、PCR和qRT-PCR鉴定转基因阳性苗,并选择差异表达的4个转基因株系用于基因功能分析。与野生型相比,转HaFAD2株系种子的含油量显著升高,脂肪酸组成发生改变,总不饱和脂肪酸含量升高,亚油酸合成下游的大部分脂肪酸含量显著升高,而亚油酸合成上游的大部分脂肪酸含量显著降低。克隆了核苷酸序列长度为867 bp的HaFAD2启动子,根据启动子区潜在顺式作用元件预测,以及HaFAD2与转录因子表达量的聚类热图和相关性分析,推测bHLH96很可能是HaFAD2上游调控的转录因子。


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1 刘岩;高油酸向日葵种子不同发育时期全转录组分析及HaFAD2基因功能鉴定[D];东北林业大学;2021年
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